İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin
Summary
Birincil fare kardiyomyosit kültürleri miyofibriler organizasyon ve fonksiyon soruşturma için önemli araçlardan biridir. Aşağıdaki protokol neonatal fare kalpleri birincil kardiyomiyositlerde izolasyonunu ve kültür açıklar. Elde edilen kültürler, daha sonra kardiyomiyosit biyomekanik, biyokimyasal ve hücre-biyolojik tahlillerin çeşitli için kullanılabilmektedir.
Abstract
Kültürlü neonatal kardiyomiyositler uzun myofibrillogenesis ve miyofibriler fonksiyonlarını incelemek için kullanılır olmuştur. Kültürlü kardiyomiyositler kolay soruşturma ve manipülasyon biyokimyasal yolların ve kendiliğinden kardiyomiyositlerin dayak biyomekanik özellikleri üzerine etkileri için izin verir.
Aşağıdaki 2 günlük protokol neonatal fare kardiyomiyositlerin izolasyonunu ve kültür açıklar. Biz kolayca yenidoğanlardan kalpleri incelemek kardiyak doku ayırmak ve kardiyak hücre-nüfustan kardiyomiyositlerin zenginleştirmek için nasıl göstereceğim. Bu hücre ayrışması için farklı bir enzim karışımlarının kullanımı, ve hücre canlılığı üzerindeki etkilerini tartışır. İzole edilmiş kardiyomiyositlerde sonra morfolojik elektrofizyolojik, biyokimyasal, hücre-biyolojik ya da biyo-mekanik bir çok analizde kullanılabilir. Biz sadece piyasada mevcut çözümlerini kullanarak, sağlamlık ve tekrarlanabilirlik için protokol optimize edilmiş ve enzim karışır show az lot partiye değişkenlik. Biz de kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü ile ilgili ortak sorunları çözmek ve izolasyon ve kültür koşullarının optimizasyonu için çeşitli seçenekler sunuyoruz.
Introduction
Kemirgen kalp hücrelerinin başarılı ayrışma ve kültürü için erken raporlarının 1960 1,2 dayanıyor. O zaman bile, Harary ve Farley kültürlü kardiyomiyositler "periyodik kontraktilitenin gereksinimleri çalışma için benzersiz bir sistem sağlayabilir [ve olabilir] [dayak] işlemi için çeşitli metabolik yolların katkısını belirlemek için bir araç sağlamak" olduğunu fark ettim. Genç farelerde ve özgün protokolden Harary ve Farley izole ve kültürlü kardiyomiyositler yılda uyarlanmış ve birçok bilim adamı tarafından değiştirilmiş olmasına rağmen, genel izolasyon ve kültür prosedür büyük ölçüde değişmedi. Ancak, daha iyi enzimler 3, standart çözeltiler 4,5, ve izolasyon prosedürü sırasında 6-9 hücreleri korumak için, tersinir kanal ve myosin ATPase inhibitörü BDM ilavesinin anlamlı hücre verimi ve canlılığı geliştirdi.
Yenidoğan cardiomyo vs Adultcytes
Neonatal fare veya sıçan izole edilmiş ve kültürlenmiş Kardiyomiyositler yetişkin kardiyomiyositlerde kültürler üzerinde çeşitli avantajları vardır. Yetişkin fare veya sıçanın 10 kardiyomiyositlerin izolasyonu kıyasla önemlisi, yenidoğan fare veya sıçan kalpleri için izolasyon prosedürü, daha kolay ve daha az maliyetlidir. Neonatal kardiyomiyositlerde büyük hücre verimini artırmak, ayrışma sonra bir kalsiyum-içeren bir ortam içine tekrar başlatmak için çok daha az duyarlıdır. Yetişkin kardiyomiyositler genellikle kasılmasını uyardığı volta ihtiyaç duyarken, genellikle kendiliğinden kaplamadan sonra hücreler 20 saat yenerek sonuçları Rediferansiasyon döngüsü – Başka bir büyük avantajı yenidoğan fare kardiyomiyositler daha hızlı farksızlaşma tabi olmasıdır. Yetişkin kardiyomiyositlerde transgenik DNA'nın başarılı gönderim viral vektörler gerektirir ise Neonatal kardiyomiyositlerde, hali hazırda daha da lipozomal transfeksiyon yöntemleri ile transfekte bulunmaktadır. Neonatal kardiyomiyosit aksines, yetişkin kemirgen kardiyomiyositlerinin 11-13 kültür miyofibriler bozulması ve kontraktil aparat nihai yeniden kurulması soruşturma için izin verir. Yetişkin kardiomyositlerindeki Bu karakteristik morfolojik değişiklikler, 1-2 haftalık dönemlerde ortaya çıkar. Farksızlaşma – Rediferansiasyon döngüsü böylece insan kardiyomiyopati 14 gözlenen patolojik değişikliklerin taklit eden, fetal gen program reexpression eşlik eder. Neonatal kardiyomiyositlerin kültürüne de yetişkin fare kardiyomiyositlerin diğer bir avantajı, uzun bir süre boyunca kültüre yeteneği, bu hücredir.
Fare kardiyomiyositler vs sıçan
Sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü canlı hücrelerin daha yüksek verim ve artan transfeksiyon oranları dahil olmak üzere mouse yenidoğan kardiyomiyositlerinin, o üzerinde bazı faydaları vardır. Ancak, kardiyak hastalıklar için genetiği değiştirilmiş fare modellerinin geniş kullanım (örn. </ Em> dilate kardiyomiyopati 15 için bir model olarak kas lim protein knockout fare) neonatal farelerden türetilen kardiyomiyositlerin için izolasyon prosedürü uyarlanmasına yol açmıştır. Neonatal sıçan ve fare kardiyomiyositlerde izole edilmesi için kullanılan protokoller hemen hemen aynı olmasına rağmen, daha büyük bir bakım ikincisi için uygun bir enzim karışımı seçiminde dikkate alınmalıdır. Gerçekten de, neonatal fare kardiyomiyositlerde azaltılmış verim ve hücre canlılığı ile sonuçlanan genel olarak Overdigestion karşı daha hassastır. Neonatal farelerden türetilen kardiyomiyositlerde yenidoğan sıçan kalplerinde türetilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında biraz daha küçük olduğu için Ayrıca, kaplama yoğunluğu, ayarlanmalıdır.
Morfolojik elektrofizyolojik, biyokimyasal, hücre-biyolojik ve biyomekanik parametreleri hem de myofibrillogenesis süreci için araştırılması için bir çok kullanıma sahip, kültürlü neonatal kardiyomiyositlerde çalışma için çok yönlü sistemlerinden biri haline gelmiştirin vitro kardiyak hücre fonksiyonları. Başarılı bir tahlil için ilk adım, ancak, neonatal fare kardiyomiyositlerde izole etmek için kolay ve güvenilir bir yöntem bağlıdır. Bizim protokol birçok kaynaktan metodolojisini çizer ve tekrarlanabilirlik ve sağlamlık için optimize edilmiştir. Biz kardiyomyosit-verim ve canlılığını etkileyen faktörleri tartışmak ve izolasyon ve kültür koşullarının optimizasyonu için çeşitli seçenekler sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kalp hastalıklarının çalışma hayvan modellerin kullanımı Kardiyovasküler araştırmalarda standart haline gelmiştir. Bu modellerin yakından biyokimyasal karakterizasyonu (örneğin, biyokimyasal ya da biyo-mekanik uyarıcılara kalp hücrelerinin doğrudan yanıtları eğitim), genellikle kalp dokularının veya kardiyomiyositlerin izole edilmesini gerektirmektedir. Kalbin fizyolojik tepkileri araştıran çalışmalar ex vivo (örneğin 40 asetilkolin, ya da iskemi reperfüzyon s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Prof fahri Jean-Claude Perriard ve Evelyn Perriard yenidoğan sıçan ve fare kardiyomiyosetlere izolasyon teknikleri içine giriş için (Teknoloji, İsviçre İsviçre Federal Enstitüsü) müteşekkiriz. Biz onların destek için Prof Ju Chen ve Prof Sylvia Evans (UCSD, ABD) teşekkür etmek istiyorum. EE laboratuvar İş MRC Kariyer kurulması Grant tarafından finanse edildi. SL NIH / enstitünün (HL107744) dan bağımsızlık ödül için K99/R00 yolu tarafından desteklenmektedir. TMM Amerikan Kalp Derneği (11POST7310066) bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|
References
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131, 1674-1675 (1960).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies on single beating rat heart cells. I. Growth and organization. Exp. Cell Res. 29, 451-465 (1963).
- Worthington Biochemical Corp. . Worthington Enzyme Manual. , (2012).
- Hanks, J. H., Wallace, R. E. Relation of oxygen and temperature in the preservation of tissues by refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71, 196-200 (1949).
- Leibovitz, A. The Growth and Maintenance of Tissue-Cell Cultures in Free Gas Exchange with the Atmosphere. Am. J. Hyg. 78, 173-180 (1963).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ. Res. 65, 1441-1449 (1989).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1, 61-72 (2001).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 272, 875-885 (1997).
- Allen, T. J., Chapman, R. A. The effect of a chemical phosphatase on single calcium channels and the inactivation of whole-cell calcium current from isolated guinea-pig ventricular myocytes. Pflugers Arch. 430, 68-80 (1995).
- Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Cultured adult cardiac myocytes: future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties. Cardiovasc. Res. 39, 280-300 (1998).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 14, 397-412 (1982).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev. Biol. 80, 466-482 (1980).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130, 1-15 (1988).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends Cardiovasc Med. 4, 187-193 (1994).
- Arber, S., et al. MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure. Cell. 88, 393-403 (1997).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- Worthington Biochemical Corp. . Worthington Tissue Dissection Guide. , (2012).
- Bashor, M. M. Dispersion and disruption of tissues. Methods Enzymol. 58, 119-131 (1979).
- Speicher, D. W., McCarl, R. L. Pancreatic enzyme requirements for the dissociation of rat hearts for culture. In Vitro. 10, 30-41 (1974).
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Exp Cell Res. 53, 1-10 (1968).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , (2010).
- Lange, S., Perera, S., Teh, P., Chen, J. Obscurin and KCTD6 regulate cullin-dependent small ankyrin-1 (sAnk1.5) protein turnover. Mol Biol Cell. , (2012).
- Sen, A., Dunnmon, P., Henderson, S. A., Gerard, R. D., Chien, K. R. Terminally differentiated neonatal rat myocardial cells proliferate and maintain specific differentiated functions following expression of SV40 large T antigen. J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 (1988).
- Evans, H. J., Goodwin, R. L. Western array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Mol. Cell Biochem. 303, 189-199 (2007).
- Bakunts, K., Gillum, N., Karabekian, Z., Sarvazyan, N. Formation of cardiac fibers in Matrigel matrix. Biotechniques. 44, 341-348 (2008).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, 669-679 (2000).
- Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat. Biotechnol. 30, 792-797 (2012).
- Das, M., et al. Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on an organosilane surface in a serum-free medium. Biomaterials. 25, 5643-5647 (2004).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PLoS One. 5, e13039 (2010).
- VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. Cardiogel: a biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 32, 478-485 (1996).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128, 376-382 (1985).
- Steinhelper, M. E., et al. Proliferation in vivo and in culture of differentiated adult atrial cardiomyocytes from transgenic mice. Am. J. Physiol. 259, H1826-H1834 (1990).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J. Cell Sci. 117, 3295-3306 (2004).
- Iwaki, K., Sukhatme, V. P., Shubeita, H. E., Chien, K. R. Alpha- beta-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells. fos/jun expression is associated with sarcomere assembly; Egr-1 induction is primarily an alpha 1-mediated response. J. Biol. Chem. 265, 13809-13817 (1990).
- Kirshenbaum, L. A., MacLellan, W. R., Mazur, W., French, B. A., Schneider, M. D. Highly efficient gene transfer into adult ventricular myocytes by recombinant adenovirus. J. Clin. Invest. 92, 381-387 (1993).
- Maeda, Y., et al. Adeno-associated virus-mediated transfer of endothelial nitric oxide synthase gene inhibits protein synthesis of rat ventricular cardiomyocytes. Cardiovasc Drugs Ther. 15, 19-24 (2001).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic Res. Cardiol. 97, 348-358 (2002).
- Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Mol. Biotechnol. 28, 21-32 (2004).
- van Bever, L., et al. Pore loop-mutated rat KIR6.1 and KIR6.2 suppress KATP current in rat cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, 850-859 (2004).
- Sakai, K., Akima, M., Tsuyama, K. Evaluation of the isolated perfused heart of mice, with special reference to vasoconstriction caused by intracoronary acetylcholine. J. Pharmacol Methods. 10, 263-270 (1983).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94, 54-70 (2009).
- Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. J. Vis. Exp. (42), e2069 (2010).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Zakharova, L., Nural-Guvener, H., Gaballa, M. A. Cardiac explant-derived cells are regulated by Notch-modulated mesenchymal transition. PLoS One. 7, e37800 (2012).
- Rudy, D. E., Yatskievych, T. A., Antin, P. B., Gregorio, C. C. Assembly of thick, thin, and titin filaments in chick precardiac explants. Dev. Dyn. 221, 61-71 (2001).
- Thum, T., Borlak, J. Reprogramming of gene expression in cultured cardiomyocytes and in explanted hearts by the myosin ATPase inhibitor butanedione monoxime. Transplantation. 71, 543-552 (2001).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 294, H1667-H1674 (2008).
