Выделение и Культура неонатологическую мыши кардиомиоцитов

Summary

Первичные культуры мыши кардиомиоцитов являются одним из ключевых инструментов для исследования миофибриллярного организации и функции. Следующий протокол описывает выделение и культуру первичных кардиомиоцитов из неонатальных мышиных сердцах. Полученные культуры кардиомиоцитов, может быть впоследствии использованы для различных биомеханических, биохимических и клеточных биологических анализов.

Abstract

Искусственный неонатальные кардиомиоциты уже давно используются для изучения myofibrillogenesis и миофибриллярные функции. Искусственный кардиомиоциты позволяют легко расследования и манипуляции биохимических путей, и их влияние на биомеханических свойств спонтанно избиении кардиомиоцитов.

Следующий протокол уровня 2-дневного описывает выделение и культуру неонатальных кардиомиоцитов мыши. Мы покажем, как легко препарировать сердца от новорожденных, отделить сердечную ткань и обогатить кардиомиоциты от сердечной клетки-населения. Обсуждается использование различных ферментных смесей для клеток-диссоциации, и их влияние на клетки-жизнеспособности. Выделенные кардиомиоциты могут быть впоследствии использованы для различных морфологических, электрофизиологических, биохимических, клеточных биологических или-биомеханические анализов. Мы оптимизировали протокол для надежности и воспроизводимости, с помощью только имеющиеся в продаже решений и фермент смешивает, что шой немного партии к партии изменчивость. Мы также решения общих проблем, связанных с изоляцией и культуры кардиомиоцитов, и предлагают различные варианты для оптимизации выделения и культивирования условиях.

Introduction

Самые ранние сообщения для успешного диссоциации и культуры клеток сердца грызунов восходит к 1960-х годов ^1,2. Даже тогда, Харари и Фарли заметил, что культивируемые кардиомиоциты »вправе оказывать уникальную систему для изучения требований периодической сократительной [и может] обеспечивают средства определения вклада различных метаболических путей для [бьющегося] процесс". Хотя Харари и Фарли выделяют и культивируют кардиомиоциты от молодых крыс и оригинального протокола была адаптирована и изменение многими учеными на протяжении многих лет, общий порядок выделения и культивирования не сильно изменилась. Тем не менее, лучше ферменты ^3, стандартизованные растворы ^4,5, и добавление обратимого ингибитора канала и миозин АТФазы БДМ, чтобы защитить клетки во время процедуры выделения ^6-9 значительно улучшилось сотовый выход и жизнеспособность.

Взрослый против новорожденных кардиомиоцитовциты

Кардиомиоциты выделяют и культивируют с новорожденных мышей или крыс имеют ряд преимуществ перед культур взрослых кардиомиоцитов. Прежде всего, процедура изоляции для новорожденных мыши или крысы сердца легче и дешевле, по сравнению с выделением кардиомиоцитов из взрослой мыши или крысы ^10. Неонатальные кардиомиоциты гораздо менее чувствительны к реинтродукции в кальция среде, содержащей после диссоциации, что значительно увеличивает выход сотовый. Другим большим преимуществом является то, что неонатальные кардиомиоциты мыши подвергаются более быстрому дедифференцировки – повторной дифференцировки цикл, который обычно приводит к спонтанно бить элементов 20 час после посева, в то время как взрослые кардиомиоциты обычно требуют ходить, чтобы вызвать сокращение. Новорожденных кардиомиоцитов также более легко transfectable с методами липосомальный трансфекции, в то время как взрослые кардиомиоциты требуют вирусных векторов для успешной сдачи трансгенной ДНК. В отличие от новорожденных кардиомиоцитовс, культура взрослых грызунов кардиомиоцитов ^11-13 позволяет для исследования миофибриллярного деградации и в конечном итоге восстановления сократительного аппарата. Эти характерные морфологические изменения у взрослых кардиомиоцитов происходить в течение периодов 1-2 недель. Дедифференцировка – цикл повторной дифференцировки сопровождается reexpression программы генной плода, тем самым имитируя патологические изменения, наблюдаемые в человека кардиомиопатии ^14. Еще одним преимуществом взрослых кардиомиоцитов крыс через культуре неонатальных кардиомиоцитов является способность культуры эти клетки в течение длительных периодов времени.

Крыса против кардиомиоцитов мыши

Выделение и культура крыс неонатальных кардиомиоцитов имеет некоторые преимущества по сравнению с, что из мыши неонатальных кардиомиоцитов, в том числе более высокий выход жизнеспособных клеток и увеличение ставок трансфекции. Тем не менее, широкое использование генетически модифицированных моделях мыши для сердечных заболеваний (например, </ EM> мышца Ит белок нокаут мыши в качестве модели для дилатационной кардиомиопатией ¹⁵⁾ привело к адаптации процедуры выделения для кардиомиоцитов, полученных из новорожденных мышей. Хотя протоколы, используемые для изоляции новорожденной крысы и мыши кардиомиоцитов почти идентичны, больше необходимо позаботиться в подборе подходящей смеси ферментов для последнего. Действительно, неонатальные кардиомиоциты мыши, как правило, более чувствительны к избытком, что приводит к снижению клеточной жизнеспособности и выходом. Кроме того, плотность покрытия должна быть скорректирована, так как кардиомиоциты, полученные из новорожденных мышей несколько меньше по сравнению с клетками, полученными от новорожденных сердцах крыс.

С многих применений для исследования морфологических, электрофизиологических, биохимических, клеточных биологических и биомеханических параметров, а также для процесса myofibrillogenesis, культивированный неонатальные кардиомиоциты стали одним из самых универсальных систем для изученияфункции клеток сердца в пробирке. Первый шаг к успешному анализе однако, зависит от простой и надежный методологии выделения неонатальных кардиомиоцитов мыши. Наш протокол рисует свою методологию из многих источников и была оптимизирована для воспроизводимости и надежности. Мы обсуждаем факторы, влияющие на кардиомиоциты выход и жизнеспособность, а также обеспечить различные варианты для оптимизации выделения и культивирования условиях.

Protocol

Следующая процедура описывает протокол 16,17 двухдневный для изоляции и культуре неонатальных кардиомиоцитов мыши. Все растворы должны быть стерильными или стерильно фильтруют. Все инструменты стерилизуют путем стерилизации поверхности 75% этанолом. Для первоначальной экстракци…

Representative Results

Используя этот протокол, мы изолировали сердца от 8 однодневных новорожденных мышей (Фигуры 1A, 1B, Дополнительное Movie S1). После промывки и мясорубки сердца с ножницами (Цифры 1С-1F), фрагменты ткани были приготовленный к употреблению в изоляции среды в течение ночи при 4 ° С…

Discussion

Использование животных моделях для изучения сердечных заболеваний стала стандартом в сердечно-сосудистых исследований. Ближе биохимическая характеристика этих моделей (то есть изучения прямые ответы сердечных клеток в биохимических или биомеханических стимулы), как правило, т?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.