Summary
Инфицирование предстательной железы может быть фактором в посредничестве тазовой боли при хроническом простатите. Мы описываем порядок подготовки стандартизированных бактериальной посевной, инстилляции бактерий в мочеиспускательный канал самцов мышей и методологии для измерения тактильной аллодинии у мышей с течением времени.
Abstract
Uropathogenic кишечной палочки (УПЭК) являются патогенные микроорганизмы, которые играют важную роль в инфекции мочевыводящих путей и бактериальный простатит 1. Недавно мы показали, что УПЭК играют важную роль в инициировании хронической тазовой боли 2, особенностью хронического простатита / синдрома хронической тазовой боли (CP / CPPS) 3,4. Инфекция простаты клинически значимых УПЭК могут инициировать и установить хронических болей с помощью механизмов, которые могут включать повреждения тканей и начала механизмы аутоиммунных 5.
Задача для понимания патогенеза УПЭК в предстательной железе является относительной недоступности предстательной железы манипуляции. Мы использовали ранее описанный метод внутримочеиспускательные инфекции от 6 до доставки клинического штамма УПЭК в самцах мышей таким образом устанавливая восходящей инфекции предстательной железы. Здесь мы описываем наши протоколы для стандартизации баcterial посевной 7, а также процедура катетеризации наркозом мышей-самцов для закапывания бактерий.
CP / CPPS в первую очередь характеризуется наличием тактильной аллодинии 4. Поведение тестирование на основе концепции кожной гипералгезии в результате упомянутых висцерального 8-10 боли. Раздражительным фокус в висцеральных тканях снижает болевой порог кожной позволяет преувеличенной реакции на нормально не болезненные раздражители (аллодиния). Применение нормальной силы на кожу приводит к ненормальной реакции, которые имеют тенденцию к увеличению с интенсивностью основного висцеральной боли. Мы описываем методологию в NOD / ShiLtJ мышей, которые используют Фрея волокон количественно тактильной аллодинии с течением времени в ответ на одну инфекцию УПЭК бактерий.
Protocol
1. Бактерии Подготовка к мышь Прививка
Следующее должно быть сделано в асептических условиях.
- Возьмите один 17 х 100 мм трубы из полипропилена с крышками и добавить 3 мл свежего бульона Лурия (LB) средства массовой информации. Использование автоклавного советы, принять некоторые замороженные глицерина бактериями запас штамма CP1 2 и передать небольшое количество культуры в пробирку, содержащую LB СМИ. Заменить трубы колпачок так, что кислород по-прежнему в состоянии войти в трубке - культура должна расти в аэробных условиях. Место трубы при 37 ° C в инкубатор на 220 оборотов в минуту в течение ночи.
- На следующий день, передают 5 мкл ночной культуры в новую пробирку с 3 мл среды LB и расти в статических условиях в инкубаторе в течение ночи при 37 ° C.
- На 3-й день передачи 40 мкл культуры в аа 50 мл пробирку, содержащую 40 мл LB среды каждого. Место в 37 ° C в течение ночи статического инкубатора.
- Включите и установите центрифуге до 4 ° C.После центрифуг достигло конечной температуры, передавать каждое 40 мл культуры в 40 мл центрифужные пробирки Nalgene.
- Масса трубы, чтобы сбалансировать центрифуги - регулировка громкости с LB средств массовой информации по мере необходимости. Спиновые труб при 6000 оборотах в минуту в течение 20 мин.
- Осторожно удалите супернатант и осторожно приостановить бактериальных гранул в 40 мл стерильной PBS.
- Повторите шаг 1,5 с PBS.
- Аспирируйте от супернатанта и приостановить бактерий в 500 мкл стерильной PBS. Перенесите раствор в 1,5 трубку микроцентрифуге мл. Возьмите 10 мкл суспензии и разбавить в 990 мкл ледяной PBS. Использование спектрофотометра читать OD 420 нм для определения объема необходимых для прививки. Чтобы определить необходимый объем ледяной PBS приостановить гранул в: Возьмите нм OD 420 номер (в мл), и вычесть оценкам, объем бактериальных гранул [напр. OD 420 нм = 0,545, пеллеты примерно 0,075 мл. 0,545 - 0,075 = 0,470].
- Удалить 10 мкл бактериальной суспензии и дилютней в 990 мкл ледяной PBS. Читать OD 420 нм. Целью является достижение OD 420 нм значение для разбавленной суспензии 1,000 ± 0,010. Если номер вашего разведения выше этой цели, добавить больше объема подвески и взять другой чтении. Если число находится ниже 0,990, то спин вниз подвески и повторите OD 420 нм чтении до получения желаемого чтении.
2. Животное инфекции
Мыши (5 до 7 недель, десять в каждой группе) были приобретены у Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
- Мышей анестезировали путем ингаляции 1-4% изофлурана в камере плексигласа и контролируется до лежачего.
- Одна мышь в то время, принимается для закапывания бактерий, катетеризация с полиэтиленовой (PE10) катетера прикреплен к модифицированному 30 G игла шприца Hamilton стекла (длиной 1,5-2,0 см). Катетер вводится в центр иглы. Мышь НОАКред на его спинной поверхности под наркозом поддерживается с помощью носового конуса.
- Пенис мыши выдавливается на мягкое давление и либеральной количества смазки на ватные тампоны используется для смазки вход в уретру полового члена.
- 10 мкл фосфатно-солевой буфер, содержащий 1 х 10 8 бактерий вводят в уретру наркозом мышей после катетеризации.
- Мышь поддерживается в состоянии наркоза в течение 15 мин в камере оргстекла после введения бактериальных, чтобы прикрепление бактерий и предотвращения непосредственной мочеиспускания.
- Мышей помещают обратно в их клетках и контролируется в течение следующих 24 часов.
3. Поведение Тестирование
Мыши были протестированы перед инфекцией (базовый уровень) и на 3, 7, 14, 21 и 28 после заражения. Приглашенный гипералгезии и тактильная аллодиния была проверена с помощью Фрея нитей применяется к животу 11,12 и подошвенной гEgion задней лапы 13. Тестирование исполнялись при фиксированном времени суток, стандартная методология и одного тестирования экспериментатор всех животных были заняты. Ослепленный тестирование групп была использована для борьбы с ограничениями поведения на основе тестирования боли в животных моделях. Пять отдельных Фрея нитей с силами 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 и 4,0 г (Stoelting, США) были применены к животу и частоту вывода ответов был рассчитан.
- После 30 мин период акклиматизации, мышей помещают в отдельные камеры оргстекла (6 х 10 х12 см) собственного производства из нержавеющей этаже проволочной сетки стали.
- Приглашенный гипералгезии и тактильной аллодинии были протестированы с использованием пяти Фрея нитей. Каждая нить была применена в течение 1-2 сек, между стимулом интервалом в 5 секунд в общей сложности 10 раз, а волосы были проверены в порядке возрастания силы.
- Каждая нить наносится на нижнюю область живота в общем близости от простаты ибыли приняты меры для стимулирования различных областей в пределах этой области, чтобы избежать десенсибилизации или "ветер" эффектов. Нити были применены в порядке возрастания силы в течение 1-2 секунд, по крайней мере, 5-секундными интервалами между раздражениями в общей сложности 10 раз.
- Три типа поведения считается положительным ответом на стимуляцию нити: 1) резкое втягивание живота; 2) немедленное лизать или царапин на площадь накаливания стимуляции; 3) прыжки.
- Частота срабатывания рассчитывается как процент положительных ответов (из 10, например, 5 ответов 10 = 50%) и данные были представлены как средний процент ответов частоты ± SE
- Животные с более чем 25 положительных ответов общего базового исключены из исследования.
- Тактильная аллодиния был протестирован на подошвенной области задней лапы использованием Фрея нитей с силами 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 и 4,0 г. Среднее 50% выводе порога (5) оценивали с помощью вверх-внизМетод тестирования, где был начат с 0,04 г нити перпендикулярно к подошвенной поверхности задних лап, пока нить согнута немного. Нити были проверены в порядке возрастания до получения положительного ответа не наблюдалось. Положительный ответ на нити был определен как резкий вывод лапу или лизать теста лапу. Когда положительный ответ был записан следующий слабые нити была применена, и если отрицательный ответ наблюдалось, то в следующем сильнее нить была применена.
- Эксперименты и методологии, описанной были рассмотрены и одобрены ухода за животными Северо-Западного университета и использовать комитета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы рассмотрели NOD / ShiLtj и C57BL/6J самцов мышей на наличие хронической боли при бактериальной инфекции. Самцы мышей (5 до 7 недель) были заложены с физиологическим раствором или бактерий в мочеиспускательный канал (рис. 1). Механическое раздражение тазовой области с фон нитей Frey засоленных-привили мышей C57BL/6J и УПЭК-инфицированных мышей C57BL/6J в результате частотную, которая не изменяется в течение 28-дневного хода эксперимента (рис. 1). В отличие от УПЭК-инфицированных мышей NOD выставлены ответ на стимуляцию тазовых что было значительно больше, и остается значительно повышен до дня 28 (Р <0,05; рис. 3). Бактериальные инфекции не привело к изменениям в тактильной чувствительности подошвенной области задней лапы (данные не показаны).
tp_upload/50158/50158fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Экспериментальная схема. 1 х 10 8 бактерий, подготовленный трехдневный культуры суспендируют в PBS и закапывают в уретру наркозом мышей катетеризации. В результате тактильной аллодинии был количественно, используя Фрея нитей с силами 0,04, 0,16, 0,4, 1 и 4 г.
Рисунок 2. Методика тестирования тактильной аллодинии использованием Фрея волокон. Мыши были испытаны перед бактериальной инфекции и на пост-инфекцией дней (PID) 7, 14, 21, и 28. Три различные типы поведения рассматриваются как положительные ответы на нити стимуляции: 1) резкое втягивание живота; 2) немедленное лизать или царапин на площадь накаливания стимуляции, или 3) прыжки. Ответ часто рассчитывается как процент положительных ответов (из 10) и гата были зарегистрированы как средний процент ответов частоты ± SE.
Рисунок 3. Тактильная аллодиния индуцированных УПЭК бактерий. Ссылающиеся висцеральной гипералгезии измерялась как ответ на механическое раздражение тазовой области использования Фрея нитей из пяти калиброванных сил. Данные представлены как среднее процент положительных ответов ± SE перед закапыванием бактерий (базовый уровень) и на 7 PID, 14, 21, и 28. ANOVA показал значительное увеличение частоты ответа на PIDs 7 до 28 по сравнению с, что в базовом для всех нитей испытания в УПЭК-инфицированных NOD мышей (P <0,05). Процент ответов на каждый PID рассчитывается как общий ответ на все волокна по сравнению с исходным ответов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Инфекция простаты мыши с УПЭК позволяет в естественных условиях моделирования событий, которые могут быть задействованы в патогенезе бактериального простатита, CP / CPPS или предрасполагающие события в хроническое воспаление. Методов, описанных для бактериального препарата и закапывания опираться на большое количество литературы по УПЭК моделей в женских инфекции мочевыводящих путей 7,14. Модель имеет широкое применение для изучения патогенеза, тестирование потенциальных кандидатов вакцины и механизмы иммунной модуляции. Способность следовать боли поведения в количественной образом позволяет для изучения инфекции вызванной патогенезе боли и, возможно, в качестве доклинических моделей для тестирования боли терапии.
Есть несколько важных шагов, которые определяют успех модели инфекции мыши. В течение трех дней культуры метода при встряхивании и статические культур проводится для оптимального выражения пили, что, как известно, важна для УПЭКпривязанности к эпителиальных клеток. Она представляет собой важнейший шаг для успешной колонизации орган по УПЭК. Техника для роста бактерий были разработаны специально для УПЭК роста с шагом OD 420 оптимизированы для получения 10 мкл фосфатно-солевой буфер, содержащий 1 х 10 8 бактерий 7. Другие виды или штаммы бактерий потенциально растут с разной скоростью и стандартизации будет иметь важное значение для получения соответствующего OD, что дает 1 х 10 8 бактерий. Различные штаммы бактерий, придерживаться клеток в мочевом пузыре и простате в уникальных способов, которые во многом зависят от факторов вирулентности выраженные деформации 14. Успешное заражение мышиной простаты поэтому зависит от использования УПЭК деформации с соответствующим дополнением факторов вирулентности. Сразу же после инфекции, поддержание животных в состоянии наркоза слегка в течение как минимум 15 мин важно, чтобы модулипропашных бактерий есть время, чтобы приложить и начать патогенез до нормальных механизмов мочеиспускания очистить привил объеме из уретры.
Тактильные аллодинии у мышей является следствием основного висцеральной патологии и, таким образом, характеризуется изысканной специфику штамма-хозяина. Ранее мы уже описано, что патогенный штамм УПЭК в мужской NOD / ShiLtJ мышей вызывает аллодиния, что пики в течение 3 дней и поддерживается хронически в то время как тот же штамм не способен индуцировать аллодинии в C57BL/67 мыши 2. Наши исследования показывают, УПЭК-индуцированного ускорения аутоиммунных процессов в NOD / ShiLtJ мышей в качестве основной причины. Таким образом, хозяин генетический фон играет важную роль в развитии тактильной аллодинии. Другие важные шаги, которые являются ключевыми для объективного и успешных измерений аллодиния гарантируем, что тестер всегда знали о личности лечению, то же тестер отвечает за измерение всех времен и народов-рoints в эксперименте, использование подобных раз тестирование в течение дня, жилищные условия мышей и обеспечения стандартных условиях, как в моменты времени в эксперименте, а также между экспериментами.
Мышиной модели инфекции имеет ряд ограничений, которые должны быть тщательно рассмотрены в ходе интерпретации результатов. Бактерии привили intraurethrally иметь возможность заражения мочевого пузыря, а также предстательной железы. Это усложняет интерпретацию любой системной или общие параметры, как патология может быть от нескольких органов. Тем не менее, использование клинических и предстательной железы, полученных штаммов бактерий, а также одновременное обследование мочевого пузыря и предстательной железы позволяет соответствующей интерпретации. Кроме того, методология инфекции имитирует вероятно, восходящий модальности инфекции в человеческих самцов.
Инфекции модели, описанной здесь отличается от ранее сообщалось PRIMarily в штамм УПЭК использованы, штамма-хозяина мыши и различия в культуре методы 6 и объем бактерий закапывают в уретру 15. В настоящем исследовании используется хорошо характеризуется простаты полученных хронического простатита штамм УПЭК посредником болезни 2. Более ранние исследования использовались бактерии происходит от инфекции мочевого пузыря или острого простатита, который был использован в первую очередь для изучения воспаление, связанное событий, но не характеризуется с точки зрения тактильных аллодиния 6,15. Множество других животных моделях были сообщили, что используют аутоиммунные механизмы 5,16, гормональные манипуляции и 17 новорожденных thymectomies 18 до вызывают простатит. Хотя каждая из этих моделей есть некоторые положительные признаки, в том числе конкретных органов патологии болезни и использования уже существующих методов актуальность этих методов к реальным патогенезе CP / CPPS неизвестно. В отличие от методологии, описанной в этом человекеuscript относится к потенциальным механизмом, который был постулируется инициатором патогенезе заболевания предстательной железы. Кроме того, помимо его полезность для понимания CP / CPPS патогенеза, методы могут также быть использованы в создании и изучении хронического воспаления предстательной железы и ее роль в BPH (доброкачественная гиперплазия предстательной железы) и рак предстательной железы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом 1K01DK079019A2 (PT) от NIH / NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture tubes | BD Falcon | 352059 | |
| LB Broth Miller | EMD | EM1.10285.0500 | |
| Nalgene Centrifuge Tubes | Thermo | 3118-0050 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Catheter needle 30G | Hamilton | 91030 | |
| PE10 tubing | BD intramedic | 427400 | |
| Von Frey Filaments | Stoelting | 58025-31 |
References
- Yamamoto, S. Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coli. Journal of infection and chemotherapy official journal of the Japan Society of Chemotherapy. 13, 68-73 (2007).
- Rudick, C. N., et al. Uropathogenic Escherichia coli induces chronic pelvic pain. Infect. Immun. 79, 628-635 (2011).
- Pontari, M. A., Ruggieri, M. R.
- Schaeffer, A. J. Clinical practice. Chronic prostatitis and the chronic pelvic pain syndrome. The New England journal of medicine. 355, 1690-1698 (2006).
- Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
- Elkahwaji, J. E., Ott, C. J., Janda, L. M., Hopkins, W. J. Mouse model for acute bacterial prostatitis in genetically distinct inbred strains. Urology. 66, 883-887 (2005).
- Hultgren, S. J., Porter, T. N., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Role of type 1 pili and effects of phase variation on lower urinary tract infections produced by Escherichia coli. Infect. Immun. 50, 370-377 (1985).
- Jarrell, J., Giamberardino, M. A., Robert, M., Nasr-Esfahani, M. Bedside testing for chronic pelvic pain: discriminating visceral from somatic pain. Pain research and treatment. 2011, 692102 (2011).
- Jarrell, J. Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain. J. Vis. Exp. (28), e1232 (2009).
- Giamberardino, M. A., et al. Viscero-visceral hyperalgesia: characterization in different clinical models. Pain. 151, 307-322 (2010).
- Laird, J. M., Martinez-Caro, L., Garcia-Nicas, E., Cervero, F. A new model of visceral pain and referred hyperalgesia in the mouse. Pain. 92, 335-342 (2001).
- Laird, J. M., Souslova, V., Wood, J. N., Cervero, F. Deficits in visceral pain and referred hyperalgesia in Nav1.8 (SNS/PN3)-null mice. J. Neurosci. 22, 8352-8356 (2002).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect. Immun. 55, 373-380 (1987).
- Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. Acute bacterial inflammation of the mouse prostate. The Prostate. 72, 307-317 (2012).
- Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
- Pakarainen, T., Zhang, F. P., Makela, S., Poutanen, M., Huhtaniemi, I. Testosterone replacement therapy induces spermatogenesis and partially restores fertility in luteinizing hormone receptor knockout mice. Endocrinology. 146, 596-606 (2005).
- Taguchi, O., Kojima, A., Nishizuka, Y. Experimental autoimmune prostatitis after neonatal thymectomy in the mouse. Clinical and experimental immunology. 60, 123-129 (1985).
