斑马鱼模型的糖尿病和代谢记忆

Summary

代谢记忆的现象，其中糖尿病并发症的坚持和畅通，即使血糖正常，取得药学进展。在这里，我们描述了一个糖尿病斑马鱼模型的独特之处在于它允许参加考试的有丝分裂传播后生成分代谢记忆<em在体内</em>。

Abstract

糖尿病目前影响3.46亿人，这是到2030年预计将增加至400万。从实验室和大规模临床试验的证据已显示，糖尿病并发症的进展不受阻碍地通过即使当血糖控制药学实现代谢记忆现象。基因的表达，可以稳定地改变表观遗传变化，不仅让细胞和生物体能够快速响应不断变化的环境刺激，但也赋予能力的细胞的“记忆”一旦遇到刺激被删除。因此，角色，这些机制在代谢记忆的现象，目前正在研究之中。

我们最近报道的斑马鱼模型的Ⅰ型糖尿病的发展，这种模式的特点表明，糖尿病斑马鱼不仅显示已知的继发性并发症，包括有关的变化糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病，影响伤口愈合，但也表现出减值尾鳍再生。这种模式是独特的斑马鱼能够再生受损的胰腺和类似什么，将可望在人类患者移植后恢复正常血糖状态。此外，多个轮尾鳍截肢允许在体内系统中的分离和纯后生效应研究没有潜在的复杂因素，从以前的糖尿病状态。虽然血糖正常胰腺再生，鳍的再生和皮肤伤口愈合的糖尿病继发的持续存在下去。在鳍的再生受损的情况下，这种病理鳍的再生女儿鳍组织的多轮之后仍然保留。这些观察指出，一个基本的表观遗传过程中存在的代谢记忆状态。在这里，我们目前的需要的方法，成功地根全方位的糖尿病和代谢记忆的鱼，并讨论了该模型的优势。

Introduction

糖尿病（DM）是一个日益严重的健康问题，缩短预期寿命，由于特定的微血管疾病（视网膜病变，肾病，神经病变，影响伤口愈合）和大血管并发症（心脏疾病和中风^）1。一旦启动，糖尿病并发症的不断进步，即使血糖控制是实现不间断^2,3，这种现象被称为代谢记忆或旧的效果。这种现象的存在，临床上在20世纪90年代初的“糖尿病控制和并发症试验（DCCT）”的进展，因为已经得到了多个额外的临床试验^{4,5,6,7,8,9,10， 11,12,13,14。} DM动物模型，发现相关的病理生理学，糖尿病并发症和代谢记忆的关键。事实上，糖尿病并发症的最早记载于持久性糖尿病犬模型视网膜病变这已被使用各种在体外培养系统和动物模型^{15,16,17,18,19,20,21}几行的实验证据支持的。这些研究清楚地表明，一个的初始高血糖期间的查询结果的永久异常（包括异常的基因表达）的靶器官/细胞和机械地表明表观基因参与。

表观基因组包括所有的染色质修饰为一个特定的细胞类型，并负责细胞的独特的基因表达谱。染色体修改是动态的，在开发过程中，支持细胞分化，对外界刺激反应的，是有丝分裂稳定遗传^22,23和可以改变疾病^24,25,26。这些表观遗传机制，包括：发布翻译组蛋白修饰，非规范的组蛋白变体包含在octomers通过DNA甲基化，染色质的访问变化，基因通过微RNA的非编码^{27,28,29,30的}表达调控。总之，后生过程使细胞/生物能够快速响应不断变化的环境刺激^31,32,33，他们还赋予细胞的能力“记住”这些一旦遇到刺激被删除^23,22。因此，改变基因的表达谱是稳定的表观遗传过程产生启动信号（S）的情况下，是可遗传的，通过细胞分裂，他们都获得了极大的兴趣相关的人类疾病包括代谢记忆的分子机制。在DM和表观遗传学在其他疾病中过多的表观遗传变化引起的高血糖会导致细胞的基因调控网络的不断变化显着（审查^{34,35,36,37,38）}平行进步的背景下，新兴的结果。

斑马鱼一直是最大的模式生物，以学生DY脊椎动物的发展，但过去15年来一直呈指数级增长，利用这种微生物为研究人类疾病的^39。人类疾病的斑马鱼模型已经建立了覆盖广泛的人类疾病，包括遗传性疾病和后天疾病^40,41,42。比其他脊椎动物模式生物斑马鱼的诸多优点，包括高繁殖力，世代时间短，通过成年早期的透明度，降低住房成本和阵列的基因操纵的工具。此外，由于遗传途径和细胞之间的脊椎动物的生理和能力进行高通量药物筛选的广泛保护，斑马鱼已被成功地用于药物发现。

我们已经开发了一个成年斑马鱼模型的I型糖尿病，链脲佐菌素致糖尿病药物。我们这一模型显示，糖尿病斑马鱼T仅显示已知的人类继发性并发症，但除此之外，表现出肢体再生障碍（尾鳍再生）的高血糖环境的后果。此外，我们曾报道过，高血糖斑马鱼恢复到正常血糖水平在2周内由于在生理上正常的血糖状态的内源性胰岛β细胞再生的药物清除。然而，与此相反，这些鱼的肢体再生的仍然减值到相同的程度，在这种并发症的糖尿病急性状态仍然存在，并容易代谢记忆。产生这种模式的主要动力是提供一个系统研究的有丝分裂稳定的表观遗传代谢记忆现象的组件，支持在以前的高血糖环境的背景噪音的情况下。在该协议的结论这里提供的斑马鱼和或选择性组织可以处理任何适合的resea测定rchers需要。我们已经成功地使用了此程序，以确定在DNA甲基化的基因组范围内的持久改变代谢内存状态²¹被保持在由高血糖引起的。

我们认为，这种斑马鱼模型的I型糖尿病有几个创新的优势，其他的模型系统研究代谢记忆。 1）所有我们的研究可以在体内进行的和以前的高血糖鱼通过返回到正常血糖的内源性胰岛素生产的再生，它们不需要外源性胰岛素注射。因此，这样就避免了复杂的血糖控制可能发生的需要外源性胰岛素在动物的峰值和低谷。 2）如上所述，从以前的糖尿病状态（ 即晚期糖基化终端产品和活性氧标志物的继续存在）的背景刺激被淘汰，因此可以检查纯粹epig代谢记忆的enetic因素。 3）的实验，可以迅速地进行，因为它需要约80天诱导糖尿病直到代谢记忆检查。 4）尾鳍再生实验非常平易近人，和允许容易的遗传和实验操作，有大量的工具。 5）尾鳍再生提供了一个非常简单的，可量化的方法来评估代谢记忆，因此将允许未来的药物发现。

Protocol

所有程序中的“实验动物护理原则的指引”（美国国立卫生研究院出版。85-23号，1985年修订）和罗莎琳德·富兰克林大学实验动物护理和使用委员会的动物协议08-19。 有2个重要的这个手稿中所使用的缩写。 1）DM：是指鱼（300毫克/分升）在急性高血糖状态，并已在至少3个星期。 2）MM：是指鱼，分别为21天（见协议）DM鱼和胰腺再生，恢复血糖控制。这是实现内的去除药物（14?…

Representative Results

Ⅰ型糖尿病的斑马鱼不仅显示已知的继发性并发症视网膜病变和肾病患者，但也表现出额外的复杂性：尾鳍再生受损。这以后的并发症仍然存在，由于代谢记忆中的鱼，已经恢复了正常的血糖控制高血糖期。在图2A中（对照）和图2B（代谢记忆）代表图像再生的散热片，在72小时后截肢捕获。可以量化和图2C DM和MM斑马鱼表现出赤字约为40％，在72小时时相比，?…

Discussion

糖尿病是一种疾病，代谢失调，高血糖，最终导致血管损伤，导致许多并发症，坚持，即使血糖正常实现，但药物干预后，初步诊断为。这种持久性的并发症，被称为“代谢记忆和最近一些研究研究，表观遗传机制的作用发挥这种现象。在这里，我们已经详细介绍了协议，允许糖尿病急性代谢记忆（恢复血糖控制）斑马鱼产生的。我们进一步描述的方法，可以采用从以前的糖尿病状态的组件的潜?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
QuantiChrome glucose assay kit.	Bioassay Systems	DIGL-100
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.