Un modelo de pez cebra de la diabetes mellitus y la memoria metabólica

Summary

Memoria metabólica es el fenómeno por el cual las complicaciones diabéticas persistir y progresar sin obstáculos, incluso después de euglucemia se logra farmacéuticamente. Aquí se describe un modelo de pez cebra diabetes mellitus, que es la única que permite el examen de los componentes epigenéticos mitóticamente transmisibles de memoria metabólica<em> In vivo</em>.

Abstract

La diabetes mellitus afecta actualmente a 346 millones personas y se prevé que aumente a 400 millones para el 2030. Evidencia desde el laboratorio y ensayos clínicos grandes escala ha revelado que el progreso complicaciones diabéticas sin obstáculos a través del fenómeno de la memoria metabólica incluso cuando el control glucémico se logra farmacéuticamente. La expresión génica puede ser alterada de forma estable a través de cambios epigenéticos que no sólo permiten a las células y los organismos para responder rápidamente a las cambiantes estímulos ambientales pero también confieren la capacidad de la célula de "memorizar" estos encuentros, una vez que el estímulo se retira. Como tal, los papeles que desempeñan estos mecanismos en el fenómeno de memoria metabólica se están estudiando actualmente.

Hemos informado recientemente el desarrollo de un modelo de pez cebra de tipo I diabetes mellitus y caracterizado este modelo para demostrar que el pez cebra diabético no sólo mostrar las complicaciones conocidas secundarias, incluyendo los cambios asociadoscon la retinopatía diabética, nefropatía diabética y curación de la herida, pero también presentan regeneración afectada aleta caudal. Este modelo es único en que el pez cebra es capaz de regenerar su páncreas dañada y restaurar un estado euglucémico similar a lo que sería de esperar en post-trasplante de pacientes humanos. Además, múltiples rondas de amputación aleta caudal permiten la separación y el estudio de los efectos epigenéticos puros en un sistema in vivo sin posibles factores de complicación desde el estado diabético anterior. Aunque la euglucemia se consigue después de la regeneración de páncreas, la complicación de la diabetes secundaria de la regeneración de la aleta y la curación de heridas de piel persiste indefinidamente. En el caso de la regeneración de aleta alterada, esta patología se conserva incluso después de múltiples rondas de regeneración de aleta en los tejidos hija de aleta. Estas observaciones apuntan a un proceso subyacente epigenética existente en la memoria de estado metabólico. A continuación se presentan los métodos necesarios para pasar satisfactoriamente geneRate los grupos de memoria diabéticos y metabólicos de los peces y discutir las ventajas de este modelo.

Introduction

La diabetes mellitus (DM) es un problema de salud grave y creciente que da lugar a la esperanza de vida reducida debido a la enfermedad microvascular específica (retinopatía, nefropatía, neuropatía, curación lenta de heridas) y macrovasculares (enfermedad cardiaca y accidente cerebrovascular) Complicaciones ^1. Una vez iniciadas, las complicaciones diabéticas continuará progresando sin interrupciones, incluso cuando el control glucémico se consigue ^2,3 y este fenómeno se ha denominado memoria metabólica o el efecto legado. La presencia de este fenómeno fue reconocido clínicamente durante la década de 1990 como el "The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)" progresado y ya ha recibido el apoyo de múltiples ensayos clínicos adicionales ^{4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14.} Los modelos animales de DM han sido críticos para los descubrimientos relacionados con la fisiopatología de las complicaciones diabéticas y la memoria metabólica. De hecho, la persistencia de las complicaciones diabéticas se documentó por primera vez en un modelo canino de diabéticaretinopatía que desde entonces ha sido apoyado por varias líneas de evidencia experimental utilizando una variedad de sistemas de cultivo in vitro y modelos animales ^{15,16,17,18,19,20,21.} Estos estudios muestran claramente que un período inicial de resultados hiperglucémicos en anomalías permanentes (incluyendo la expresión génica aberrante) de los órganos diana y / células mecánicamente sugiere la participación del epigenoma.

Epigenomas consistirá en todas las modificaciones de la cromatina para un determinado tipo de células y son responsables de perfil único gen de una célula de expresión. Las modificaciones cromosómicas son dinámicos durante el desarrollo, la diferenciación de células de soporte, responden a estímulos externos, están mitóticamente establemente heredados ^22,23 y puede ser alterado en la enfermedad ^24,25,26. Estos mecanismos epigenéticos incluyen: después de la traducción modificaciones de las histonas y no histonas variante canónica de inclusión en octomers, cambios en la cromatina de acceso a través de la metilación del ADN y los genescontrol de la expresión a través de no codificante RNAs micro ^27,28,29,30. En conjunto, los procesos epigenéticos permitir que las células / organismos para responder rápidamente a las cambiantes estímulos ambientales ^31,32,33, también confieren la capacidad para la célula "aprende" estos encuentros, una vez que el estímulo se retira ^23,22. Por lo tanto, como alteración de perfiles de expresión génica que resultan de los procesos epigenéticos son estables en ausencia de la señal (s) que los inició y se heredables a través de la división celular, que han adquirido gran interés como mecanismos moleculares subyacentes de patologías humanas, incluyendo la memoria metabólica. Los resultados que surgen en el contexto de la MS y la epigenética avances paralelos en otras enfermedades en las que una gran cantidad de cambios epigenéticos inducidos por la hiperglucemia producen notables cambios persistentes en las redes transcripcionales de las células (revisado en ^{34,35,36,37,38).}

El pez cebra ha sido durante mucho tiempo un organismo modelo principal para estudiantesdy desarrollo de los vertebrados sin embargo en los últimos 15 años ha experimentado un crecimiento exponencial en la utilización de este organismo para el estudio de las enfermedades humanas. ^39. Modelos de pez cebra de la enfermedad humana han establecido que abarca una amplia gama de patologías humanas, incluyendo trastornos genéticos y las enfermedades adquiridas ^40,41,42. Las muchas ventajas del pez cebra con respecto a otros organismos vertebrados modelo incluyen alta fecundidad, corto tiempo de generación, la transparencia a través de la edad adulta temprana, la reducción de los costos de vivienda y una serie de herramientas para la manipulación de genes. Además, debido a la conservación extensa de las vías genéticas y la fisiología celular entre los vertebrados y de la capacidad para llevar a cabo exámenes de drogas de alto rendimiento, el pez cebra se ha utilizado con éxito para el descubrimiento farmacéutico.

Hemos desarrollado un modelo de pez cebra adulto de diabetes mellitus tipo I que usaban el medicamento diabetogénico, estreptozocina. Hemos caracterizado este modelo para mostrar que el pez cebra diabético not sólo muestran las conocidas complicaciones secundarias humanos pero, además, exponer regeneración extremidad afectada (regeneración aleta caudal) como consecuencia del medio ambiente hiperglucémico. Además, se ha informado que el pez cebra hiperglucémico volver a normalizar la glucemia dentro de las 2 semanas de eliminación del fármaco debido a la regeneración de células beta pancreáticas endógenas resultantes en un estado glucémico fisiológicamente normal. Sin embargo, en contraste, la regeneración de miembros en estos peces sigue siendo afectada en la misma medida que en el estado diabético agudo indicando esta complicación persiste y es susceptible a la memoria metabólica. El principal impulso para la generación de este modelo era proporcionar un sistema para estudiar los componentes epigenéticos mitóticamente estables que soportan el fenómeno de memoria metabólica en ausencia del ruido de fondo del entorno hiperglucémico anterior. A la conclusión del protocolo al que aquí los tejidos de pez cebra o selectivos y pueden ser procesados ​​por cualquier ensayo adecuado para la researchers necesita. Hemos utilizado con éxito este procedimiento para identificar los cambios persistentes en todo el genoma en la metilación del ADN inducidos por la hiperglucemia que se mantienen en la memoria de estado metabólico ^21.

Creemos que este modelo de pez cebra de diabetes mellitus tipo I tiene varias ventajas sobre los sistemas innovadores de otros modelos de examen de memoria metabólica. 1) Todos nuestros estudios pueden llevarse a cabo in vivo y como el pescado hiperglucémico anterior volver a la euglucemia a través de la regeneración de la producción de insulina endógena, que no requieren inyecciones de insulina exógena. Por lo tanto, esto evita los picos y valles de complicación en el control glucémico que pueden ocurrir en los animales que necesitan insulina exógena. 2) Como se ha descrito anteriormente, la estimulación de fondo desde el estado diabético anterior (es decir, la presencia continuada de la glucosilación avanzada de productos finales y reactivos marcadores de especies de oxígeno) son eliminados y por lo tanto, se puede examinar el puramente epigfactores Enetic de memoria metabólica. 3) Los experimentos se pueden realizar rápidamente, ya que toma aproximadamente 80 días a partir de la inducción de diabetes hasta que el examen memoria metabólica. 4) la regeneración Aleta caudal es experimentalmente muy accesible y permite una fácil manipulación genética y experimental para el que hay una gran variedad de herramientas. 5) la regeneración Aleta caudal proporciona un método muy simple y cuantificables para evaluar la memoria metabólica y por lo tanto permitirá el descubrimiento de fármacos futuro.

Protocol

Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las pautas descritas en "Principios de Cuidado de Animales de Laboratorio" (Institutos Nacionales de la Salud de la publicación no. 85-23, revisado 1985) y la aprobación Universidad Rosalind Franklin Cuidado de Animales institucional y el uso de animales Comité de protocolo 08-19. Hay 2 abreviaturas importantes que se utilizan en este manuscrito. 1) DM: se refiere a los peces que se encuentran en un estado de hiperglucemia aguda (…

Representative Results

El tipo I de pez cebra diabético no sólo muestran las complicaciones secundarias conocidas de la retinopatía y nefropatía, sino también, exhiben una complicación adicional: la regeneración alteración aleta caudal. Esta complicación más tarde persiste debido a la memoria metabólica en los peces que han restaurado el control normal de la glucosa después de un período de hiperglucemia. En la Figura 2A (control) y la Figura 2B (memoria metabólica) imágenes representativas de …

Discussion

La diabetes mellitus es una enfermedad de desregulación metabólica, diagnosticado inicialmente como la hiperglucemia, que finalmente resulta en daño del vaso sanguíneo que conduce a muchas complicaciones que todos persistir incluso después de la euglucemia se logra mediante la intervención farmacéutica. Esta persistencia de las complicaciones que se conoce como memoria metabólica y varios estudios recientes han examinado el papel que juegan los mecanismos epigenéticos en este fenómeno. Aquí se han detallado u…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
QuantiChrome glucose assay kit.	Bioassay Systems	DIGL-100
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.