Wir beschreiben ein Verfahren, um Medikamente mit dem zentralen Nervensystem Ziel entweder durch Einsetzen eines Katheters oder Durchführen einer Bolus-Injektion in die rechte laterale Ventrikel in Mäusen. Wir konzentrieren uns speziell auf den Transport von Antisense-Oligonukleotiden. Diese Technik ist leicht an andere Medikamente und Ratten.
Aufgrund der Unfähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, müssen bestimmte Medikamente direkt in das Zentralnervensystem (ZNS) geliefert werden. Unser Labor konzentriert sich speziell auf Antisense-Oligonukleotide (ASO), obwohl die Techniken in der hier gezeigten Video kann auch verwendet werden, um eine Vielzahl von anderen Drogen, um das ZNS zu liefern. Antisense-Oligonukleotide (ASO) die Fähigkeit haben, Knockdown sequenzspezifische Ziele 1 sowie Verschiebung Isoform Verhältnisse von spezifischen Genen 2. Um weit verbreitete Gen Knockdown oder Spleißen im ZNS von Mäusen zu erreichen, können die ASOs in das Gehirn über zwei separate Wege der Verabreichung, die beide zeigen wir im Video geliefert werden.
Die erste Verwendung Alzet osmotische Pumpen, die mit einem Katheter, die chirurgisch in den lateralen Ventrikel implantiert wird. Dadurch können die ASOs kontinuierlich in das ZNS für eine festgelegte Zeit infundiert werden. Die zweite besteht aus einer einzigen Bolus-Injektion von einem hallogh Konzentration von ASO in den rechten lateralen Ventrikel. Beide Verfahren verwenden die Maus zerebralen Patienten, um die ASO auf das gesamte Gehirn und Rückenmark liefern, obwohl je nach den Bedürfnissen der Studie eine Methode gegenüber der anderen bevorzugt sein.
Einige Medikamente sind nicht in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu überqueren, mit direkter Zentrales Nervensystem (ZNS) Lieferung. Um die BBB umgehen können Medikamente direkt in das Gehirn mit Hilfe der beschriebenen Verfahren geliefert werden. Während unser Labor und das Papier detaillierte hierin Fokus auf Antisense Oligonukleotide (ASO), können auch andere Drogen, wie kleine Moleküle, Antikörper, Gentherapie-Vektoren, etc., Auch durch die exakt gleiche Ansatz geliefert werden.
Bestimmte Proteine spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese von neurodegenerativen Erkrankungen. Solche Proteine bilden oft giftige Spezies und sammeln zu Aggregaten, was zu möglichen neuronalen Tod und die anschließende neurologische Erkrankung 3-4. In dem Bemühen, zu verlangsamen oder sogar stoppen das Fortschreiten dieser Erkrankungen kann eine therapeutische Option sein, das direkt auf und verringern die ursächliche Protein. Allerdings sind diese Proteine oft ubiquitär durch die ZNS, was es schwierig macht e ffectively zielen sie auf einer globalen Skala.
Um Gene während der gesamten CNS Ziel verabreichen wir ASOs in Maus-Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (CSF) über den lateralen Ventrikel die BHS zu umgehen. Diese spezielle Methode nutzt die Maus ventrikuläre System, das das gesamte Gehirn und Rückenmark umspült, so dass weite Verbreitung der ASOs. Wir verwenden die ASOs 18-20 mer RNA-Moleküle binden, die direkt die Ziel-mRNA-Sequenz sind, und je nach der ASO chemische Modifikationen, entweder A) rekrutieren RNase-H, die mRNA, die zu Knockdown verschlechtern oder B) verschieben alternatives Spleißen 1 , 2,16,17. Es sei darauf hingewiesen, dass mehrere Moleküle für das Klopfen ein spezifisches Protein in vivo, einschließlich shRNA existieren. Da diese Moleküle nicht der Schwerpunkt dieses Artikels, richten wir den Leser auf Artikel bewerten, dass eine bessere Detail Knockdown Wirkmechanismen und die Vorteile / Nachteile der einzelnen 5-6.
jove_content "> In früheren Arbeiten haben wir ASOs verwendet werden, um an die Protein Superoxiddismutase 1 (SOD1) in einem transgenen Rattenmodell Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) 7 (Abbildung 4). Mutationen im SOD1 treten bei etwa 2% aller ALS 8 Fälle, obwohl es wurde vor kurzem vermutet, dass SOD1 kann eine wichtige Rolle bei sporadischen ALS sowie 9-10. spielen Durch Verringern insgesamt SOD1 Ebenen in der ALS transgenen Ratte, das Überleben nach Beginn wurde deutlich 7 erhöht. Diese wichtigen Daten waren die ersten zu zeigen, dass eine Behandlung ASO im ZNS könnte eine tiefgreifende positive Auswirkungen auf eine neurologische Erkrankung Modell haben. Seitdem ASOs gezielt auf menschliche SOD1 eingegeben haben und absolvierte erfolgreich eine Phase-I-Studie mit menschlichen minimalen Nebenwirkungen (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , wie bei der 2012 64. Jahrestagung der American Academy of Neurology vorgestellt. Pläne, die ASOs vorwärts bewegen, um II-Studien der Phase sind derzeit im Gange. <pclass = "jove_content"> Während Targeting SOD1 war die erste Demonstration der Verwendung ASOs eine neurologische Erkrankung zu behandeln, verschiedene andere Studien wurden seitdem durchgeführt Betrachtung der verschiedenen Krankheiten und deren Zielproteine. In 2010 und 2011, dass ASOs Verschiebung Spleißen des Protein Überleben von Motoneuronen 2 (SMN2) wurden in transgenen Mausmodellen der spinalen Muskelatrophie (SMA) verwendet und führte zu einer signifikanten Verbesserung der Krankheitsphänotypen 11,12. Diese Spleißen ASOs sind jetzt in Phase I der klinischen Studien bei Kindern mit SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass transiente Verwaltung ASOs gegen die Huntingtin-Gen gezielt in der Lage dramatisch zu retten das Huntington-Mausmodell waren, selbst nachdem die Huntingtin-Protein-Spiegel zu Studienbeginn 13 zurückgegeben.In all diesen Studien wurden ASOs zu den lateralen Ventrikel geliefert gesamten Gen-Spiegel senken oder zu verändern durch Gentechnologiedie gesamte ZNS. Beide osmotische Pumpen und eine einzelne Bolusinjektion kann verwendet werden, um ASOs der CSF zu liefern. Pumpen ermöglichen eine langsame, kontinuierliche Lieferung, während die intracerebroventricular (ICV) Bolus ist eine schnelle, einmalige Injektion. Wir haben diese beiden Methoden mit Erfolg eingesetzt, obwohl wir nicht den direkten Vergleich zwischen Pumpe und Bolus in einem transgenen Linie haben berichtet.
Mit ASOs im ZNS ist eine leistungsfähige Methode, um insgesamt Protein-Ebene und / oder Veränderung Spleißen mehrerer Proteine zu verringern. Während wir ASOs ausschließlich zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen, erkennen wir, dass in anderen Bereichen kann auch von dieser Technik profitieren. Solange das Protein von Interesse wird im ZNS exprimiert und das ultimative Ziel ist es, CNS-weiten Veränderungen in der Genexpression, mit ASOs in den gezeigten Techniken zu erreichen, kann sehr nützlich sein.
Die Fähigkeit, global zu liefern Drogen im ZNS, wie in dem Video zu sehen ist eine äußerst leistungsfähige Technik, die einfach zu erlernen und zu bedienen beide ist. Mit etwas Übung kann eine einzelne Pumpe oder eine Implantation ICV Bolus in 10 min abgeschlossen sein, so dass für große Kohorten von Mäusen zur gleichen Zeit behandelt werden. Dies ist besonders nützlich für Studien mit einer Verhaltens-Anzeige, wie eine größere Anzahl für Mausverhalten kritisch, um zu einer wesentlichen Unterschiede.
Basierend auf unseren Erfahrungen liefern ASOs über Pumpen und Bolus-Injektionen, haben wir einige Vor-und Nachteile jeder Methode beobachtet. Es sollte angemerkt werden, dass diese die Meinungen in unserem Labor sind und möglicherweise nicht für alle Maus und Ratte Modelle wahr werden.
Wir finden, ein Vorteil der Verwendung der Pumpen ist ihre Fähigkeit, eine große Menge an ASO, da die ASO über einen viel längeren Zeitraum verteilt liefern. Diese Regel entspricht länger anhaltende Knockdown oder Spleißen nach aktiverASO Infusion, obwohl dies nicht immer der Fall sein. Die Pumpen ermöglichen auch einen genauen Zeitrahmen von ASO Lieferung (14 Tage, 28 Tage, oder 42 Tage) und die Pumpen einmal geändert werden, um für noch mehr aktiv ASO Infusion zu ermöglichen. Wir haben jedoch festgestellt, dass eine Änderung Pumpen mehr als einmal erhöht die Variabilität aufgrund der Bildung von faserigen Taschen um die Pumpe, die Pumpe ordnungsgemäß Absorptionsflüssigkeit zu verhindern. Ein Nachteil der Pumpen ist, dass einige Mäuse nicht dulden, die Pumpe sowie andere. Wenn die transgene Linie mit dem Sie arbeiten ist zerbrechlich, kann eine Pumpe zu umständlich. Die Pumpen müssen auch nach dem letzten Infusion entfernt werden, unterwirft die Mäuse zu einer anderen Operation und Anästhesie added. Wenn dabei Verhalten zu umgehen, ist es besonders wichtig, um die Pumpe zu entfernen und damit für mindestens 1-2 Wochen der Erholung, da die Anwesenheit der Pumpe einige Verhaltensweisen in den Mäusen beeinflussen.
Mit ICV Bolusinjektionen ist ein Vorteil Kosten. Es ist einVorab-Investition zum Kauf der Spritzen und Nadeln, aber im Laufe der Zeit, sind Bolusinjektionen kostengünstiger, da keine Pumpen / Schläuche / Katheter zu erwerben sind. Insgesamt gibt es weniger mit den ICV Bolusinjektionen aufgrund des Fehlens von Kanülen und pumpt-halten. Wir finden auch, dass ICV Bolus verwendet werden, um ASOs zu jüngeren und / oder anfälliger Mäuse liefern werden. Ein Nachteil des ICV Bolus ist, dass es nur eine Injektion. Nicht so viel, insgesamt ASO kann auf diesem Weg geliefert werden, und wenn die Wirkdauer des ASO verwendet ist kurz, die Knockdown / Spleißen Effekte werden auch von kurzer Dauer sein.
Sowohl die osmotische Pumpen sowie die ICV Bolus haben die Fähigkeit, ASOs liefern, dass Can Knockdown Proteine oder ändern Spleißen von Genen im gesamten ZNS Nagetier, eine Technik, die breite Anwendungen in mehreren verwandten Bereichen Neurowissenschaften hat. Wir empfehlen Pilotierung beide Methoden der Lieferung, wenn Sie unsicher sind, welche Art der Verabreichung ist am besten geeignet für Ihre specific Studie.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten Curt Mazer von Isis Pharmaceuticals danke für die Beratung im Zusammenhang mit der ICV Bolus Chirurgie sowie Isis Pharmaceuticals als Ganzes für die Versorgung unserer Labor mit ASOs. Weiterhin möchten wir Carey Shaner für die Durchsicht dieses Artikels danken. TMM und SLD durch NIH Grants P50AG005681, K08NS074194 und R01NS078398 unterstützt.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027″, OD: 0.045″ |
0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
.2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
50 ml Conical Tubes | |||
100% Ethanol | |||
PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
Alcohol Pads | Select | #521 | |
Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
Antibiotic Cream | |||
Eye Ointment | |||
Electric Shaver | |||
70% Ethanol | |||
10% Provadone Iodine | |||
3% Hydogen Peroxide | |||
Warming Pad | |||
Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
Oxygen/Isoflurane System |