Descreve-se um método para alvejar fármacos para o sistema nervoso central por qualquer implante de um cateter ou realizar uma injecção de bolus no ventrículo lateral direito de ratos. Nós nos concentramos especificamente na entrega de oligonucleotídeos antisense. Esta técnica é facilmente adaptável a outros fármacos e a ratos.
Devido à incapacidade de atravessar a barreira hemato-encefálica, certas drogas têm de ser entregue directamente no sistema nervoso central (SNC). O nosso laboratório foca especificamente oligonucleótidos anti-sentido (ASOs), embora as técnicas apresentadas no vídeo aqui também podem ser usadas para entregar uma infinidade de outras drogas para o SNC. Oligonucleótidos anti-sentido (ASOs) têm a capacidade de knockdown alvos específicos de sequência 1, bem como índices de isoformas de transferência de genes específicos 2. Para alcançar knockdown gene generalizado ou splicing no SNC de camundongos, os ASOs podem ser entregues no cérebro usando duas rotas distintas de administração, sendo que ambos demonstramos no vídeo.
As primeiras utilizações bombas osmóticas Alzet, ligados a um cateter que é implantado cirurgicamente dentro do ventrículo lateral. Isto permite que os ASO para ser infundida continuamente para o SNC, por um período de tempo designado. A segunda envolve uma única injeção bolus de um oigh concentração de ASO no ventrículo lateral direito. Ambos os métodos utilizam o sistema do ventrículo cerebral do rato para entregar o ASO para todo o cérebro e na medula espinal, embora, dependendo das necessidades do estudo, um método pode ser preferido em detrimento do outro.
Alguns medicamentos não são capazes de atravessar a barreira hemato-encefálica (BHE), exigir Sistema Nervoso Central directa (CNS) de entrega. Para contornar a certificação, os fármacos podem ser entregues directamente para o cérebro, utilizando os métodos descritos. Enquanto o nosso laboratório e o papel detalhado aqui em foco oligonucleótidos anti-sentido (ASOs), outras drogas, tais como pequenas moléculas, anticorpos, vectores de terapia genética, etc., Pode também ser fornecido através da mesma abordagem.
Certas proteínas desempenham um papel fundamental na patogênese de doenças neurodegenerativas. Tais proteínas muitas vezes formam espécies tóxicas e se acumulam em agregados, levando à eventual morte neuronal e doença neurológica subseqüente 3-4. Num esforço para reduzir ou mesmo parar a progressão destas doenças, uma opção terapêutica pode ser diretamente alvo e diminuir a proteína causador. No entanto, estas proteínas são frequentemente encontrados ubíqua através do CNS, o que torna difícil a e ffectively orientá-las em uma escala global.
A fim de orientar genes em todo o CNS, que administramos ASOs em rato líquido cefalorraquidiano (LCR), através do ventrículo lateral para ignorar o BBB. Este método tira vantagem específica do sistema ventricular do rato que banha todo o cérebro e na medula espinal, permitindo a distribuição generalizada dos ASO. Usamos ASO que são 18-20 mer-RNA como moléculas que se ligam directamente a sequência de mRNA-alvo e, em função das modificações químicas em ASO, quer A) recruta RNase H degrada o ARNm que conduz a knockdown ou B), deslocar um splicing alternativo , 2,16,17. Deve notar-se que múltiplas moléculas existem para derrubar uma proteína específica in vivo, incluindo shRNA. Uma vez que estas moléculas não são o foco deste artigo, vamos direcionar o leitor a rever os artigos que melhores mecanismos knockdown detalhes da ação e as vantagens / desvantagens de cada um 5-6.
jove_content "> Em trabalhos anteriores, que usaram ASO para segmentar o superóxido dismutase de proteína 1 (SOD1) num modelo de rato transgénico de esclerose lateral amiotrófica (ELA), 7 (Figura 4). Mutações em SOD1 ocorrem em aproximadamente 2% de todos os ALS 8 casos, no entanto, foi recentemente SOD1 hipótese que pode desempenhar um papel importante na forma esporádica, bem 9-10. Diminuindo os níveis totais de SOD1 no rato transgénico ALS, a sobrevivência após o início foi significativamente aumentada 7. Estes dados importantes foram os primeiros para mostrar que um tratamento de ASO no SNC pode ter um profundo impacto positivo sobre um modelo de doença neurológica. Desde então, ASO orientadas para SOD1 humanos ter entrado e concluído com êxito uma Fase I de ensaios clínicos em humanos, com efeitos colaterais mínimos (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , conforme apresentado no 2012 64 º Annual Academy Americana de Neurologia. Planos para mover os ASOs para a frente para ensaios de Fase II estão em andamento. <pclasse = "jove_content"> Enquanto segmentação SOD1 foi a primeira demonstração de utilização de ASO para o tratamento de uma doença neurológica, vários outros estudos já foram realizados olhando para diferentes doenças e suas respectivas proteínas alvo. Em 2010 e 2011, ASOs essa mudança splicing da proteína sobrevivência do neurônio motor 2 (SMN2) foram usados em modelos de camundongos transgênicos de atrofia muscular espinhal (AME) e resultou em uma melhora significativa nos fenótipos da doença 11,12. Estes ASOs splicing estão agora em fase I de ensaios clínicos em crianças com SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). Adicionalmente, foi recentemente mostrado que a administração transiente de ASO dirigidas contra o gene de huntingtina foram capazes de resgatar dramaticamente o modelo de ratinho de Huntington, mesmo após os níveis de proteína huntingtina retornou à linha de base 13.Em todos estes estudos, o ASO foram entregues ao ventrículo lateral para diminuir os níveis totais do gene ou combinação de genes através de alterartodo o CNS. Ambas as bombas osmóticas e uma única injecção de bolo pode ser utilizada para entregar ASO para o CSF. Bombas para permitir uma entrega lenta, contínua, enquanto a intracerebroventricular (ICV) em bolus é um, a injecção rápida de uma só vez. Usámos estes dois métodos com sucesso, embora não tenham relatado a comparação directa entre a bomba eo bolo em uma única linha transgénica.
Usando ASOs no SNC é uma poderosa forma de diminuir os níveis de proteína total e / ou mudança de emenda de várias proteínas. Enquanto usamos ASOs exclusivamente como um tratamento para distúrbios neurológicos, reconhecemos que outras áreas também podem se beneficiar desta técnica. Contanto que a proteína de interesse é expressa no sistema nervoso central e o objectivo final é o de alcançar o SNC largas variações na expressão de genes, utilizando ASO nas técnicas demonstradas pode ser muito útil.
A capacidade para entregar drogas globalmente no SNC, como mostrado no vídeo é uma técnica poderosa que é fácil de aprender e utilizar. Com a prática, uma única bomba ou por uma implantação ICV em bolus pode ser completada em 10 min, permitindo grandes grupos de ratinhos a ser tratada ao mesmo tempo. Isto é especialmente útil para estudos com uma leitura comportamental, como números maiores para o comportamento do mouse são fundamentais para ajudar a ver diferenças significativas.
Com base em nossas experiências entregando ASO através de bombas e injeções em bolus, temos observado alguns prós e contras de cada método. Deve-se notar que estas são as opiniões em nosso laboratório e não pode ser verdadeiro para todos os modelos de rato e de ratazana.
Encontramos uma vantagem da utilização das bombas é a sua capacidade para proporcionar uma quantidade elevada de ASO desde o ASO é distribuído ao longo de um período mais longo de tempo. Isso geralmente equivale a knockdown mais sustentada ou splicing após ativoASO infusão, embora isso não seja sempre o caso. As bombas também permitem um prazo preciso de entrega ASO (14 dias, 28 dias ou 42 dias) e as bombas podem ser alterados uma vez para permitir a infusão ASO ainda mais ativo. No entanto, verificamos que a mudança bombeia mais do que uma vez aumenta a variabilidade devido à formação de bolsas fibrosas à volta da bomba para evitar que o da bomba de absorver adequadamente fluido. Uma desvantagem das bombas é que alguns ratinhos não toleram a bomba, bem como outros. Se a linhagem transgênica que você está trabalhando é mais frágil, uma bomba pode ser muito complicado. As bombas também precisam de ser removidos após a infusão final, submetendo os ratinhos a outra cirurgia e anestesia adicional. Se fazer trabalho comportamento, é especialmente importante para remover a bomba e para permitir que, pelo menos, 1-2 semanas de recuperação uma vez que a presença da bomba irá afectar alguns comportamentos nos ratinhos.
Com ICV bolus injeções, uma vantagem é o custo. Existe umainvestimento inicial para comprar as seringas e agulhas, mas ao longo do tempo, as injeções em bolus são mais custo-efetiva, pois não existem bombas / tubulação / cateteres para comprar. Em geral, há menos manter-se-com as injecções de bolus ICV, devido à falta de cânulas e bombas. Nós também descobrimos que ICV bolo pode ser utilizada para entregar ASO a ratinhos jovens frágeis e / ou mais. Uma desvantagem do ICV bolus é que é de uma única injecção. Não tanto ASO geral podem ser entregues por esta via, e se a duração da acção do ASO ser utilizado é curto, o efeito do knockdown / splicing também será de curta duração.
Ambas as bombas osmóticas, bem como os bolus ICV tem a capacidade de entregar o ASO que pode proteínas knockdown ou alteram de splicing de genes em todo o sistema nervoso central de roedores, uma técnica que tem larga aplicação em vários campos neuroscience relacionados. Sugerimos que pilotar os dois métodos de entrega, se você não souber qual a via de administração é o mais adequado para o seu sestudo ESPECÍFICAS.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Curt Mazer da Isis Pharmaceuticals para prestação de consultoria pertencente à cirurgia bolus ICV, bem como Isis Pharmaceuticals como um todo para o fornecimento de nosso laboratório com ASO. Além disso, gostaríamos de agradecer Carey Shaner pela revisão deste artigo. TMM e SLD são suportados pelo NIH concede P50AG005681, K08NS074194 e R01NS078398.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS | |||
Alzet Osmotic Pump 14 days | DURECT | Model 1002 | |
Alzet Osmotic Pump 28 days | DURECT | Model 2004 | |
Alzet Osmotic Pump 42 days | DURECT | Model 2006 | |
2.5 mm Catheters | PlasticsOne | 3280PM/SPC | Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length |
Vinyl Catheter Tubing | DURECT | 7760 | ID: 0.027″, OD: 0.045″ |
0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | NOT to be used in pumps or tubing |
0.9% Sodium Chloride, Injection, USP | Hospira | NDC 0409-4888-10 | |
p60 Petri Dish (Sterilized) | TRP | 93060 | |
Surgical Blades (Sterile) | Butler Schein | #007319 | |
Latex Surgical Gloves (Sterile) | Micro-Touch | CatNo will depend on size of the gloves needed | |
Sterile Towel Drape | Dynarex | 4410 | |
.2um Syringe Filters | PALL | 4192 | |
1 ml Syringe (Sterile) | BD | 309625 | |
50 ml Conical Tubes | |||
100% Ethanol | |||
PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS | |||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | |
Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13009-12 | |
Fine Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Curved Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Bone Cutter | Fine Science Tools | 16104-14 | |
Straight Hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl gas-tight with removable needles |
Needles | Hamilton | 7758-04 | 26 gauge, Point Style: 2 |
5-0 Nylon Suture Thread | Covidient | SN-871 | |
Alcohol Pads | Select | #521 | |
Cotton Swabs (sterile) | Puritan | REF 806-WC | |
Super Glue | Loctite | Longneck Bottles | |
CAUTION: FastGreen Dye | Sigma | F7252-5G | Wear Eyeshields and Gloves when handling this product |
Antibiotic Cream | |||
Eye Ointment | |||
Electric Shaver | |||
70% Ethanol | |||
10% Provadone Iodine | |||
3% Hydogen Peroxide | |||
Warming Pad | |||
Bead Sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1450 | |
Small Animal Stereotaxic | Kopf | Model 940 | |
Nose Cone | Kopf | Model 923-B | |
Ear Bars | Kopf | Model 921 | This model is optional |
Cannula Driver | Kopf | Model 1966 | |
Syringe Holder | Kopf | Model 1972 | |
Temperature Control System | Kopf | Model TCAT-2LV | Optional |
Oxygen/Isoflurane System |