جهاز الاستشعار البيولوجي للكشف عن المضادات الحيوية البكتيريا العنقودية الذهبية المقاومة لل

Summary

أجهزة الاستشعار فج التحللي والخرز الضد قادرون على التمييز بين ميثيسيلين مقاومة (MRSA) وبكتيريا المكورات العنقودية الحساسة. وقد ثبتوا على فاجات بطريقة انجميور-بلودجيت في الصعود إلى سطح الكوارتز الكريستال استشعار توازن دقيق وعملت تحقيقات المكورات نطاق واسع. الخرز الضد الاعتراف MRSA.

Abstract

A البكتيريا التحللي حولت هيكليا وجود مجموعة واسعة من المضيف سلالات المكورات العنقودية الذهبية وبروتين البنسلين ملزم (PBP 2A) وقد تم استخدام الأجسام المضادة حبات اللاتكس مترافق لإنشاء جهاز الاستشعار البيولوجي المصممة للتمييز من ميثيسيلين مقاومة (MRSA) وحساس (MSSA) S . أنواع المكورات ^1،2. وقد تم تحويل فاجات التحللي في الأجسام الشبه الكروية فج عن طريق الاتصال مع واجهة كلوروفورم المياه. تم نقل فج الطبقات الوحيدة كروي على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي بواسطة انجميور-بلودجيت (LB) تقنية ^3. وقد تم فحص أجهزة الاستشعار التي تم إنشاؤها بواسطة توازن دقيق الكريستال الكوارتز مع تتبع تبديد (QCM-D) لتقييم التفاعلات البكتيريا فج. أدت التفاعلات البكتيريا كروي إلى انخفاض تردد صدى وارتفاع في الطاقة تبديد لكل من هذه الجرثومة وسلالات MSSA. بعد الربط البكتيرية، وقد تم كشف أكثر هذه المجسات إلى الأجسام المضادة بروتين البنسلين ملزم اللاتكس حبةق. استجابت أجهزة الاستشعار تحليلها مع هذه الجرثومة إلى PBP الخرز الضد 2A، على الرغم من أجهزة الاستشعار تفقد مع MSSA أعطى أي رد. هذا التمييز التجريبية يحدد على التمييز بين لا لبس فيها ميثيسيلين مقاومة وS. الحساسة سلالات المكورات. ملزمة على قدم المساواة والبكتيريا غير منضم قمع نمو البكتيريا على الأسطح ومعلقات في المياه. مرة واحدة يتم تغيير فاجات التحللي في الأجسام الشبه الكروية، فإنها تحتفظ نشاطهم التحللي قوية وإظهار عالية القدرة على التقاط البكتيرية. ويمكن استخدام الأجسام الشبه الكروية فج فج وللاختبار وتعقيم من الكائنات الحية الدقيقة المقاومة للمضادات الحيوية. ويمكن أن تشمل التطبيقات الأخرى استخدامها في علاج البكتيريا والأسطح المضادة للميكروبات.

Introduction

وقد اقترحت ميثيسيلين سلالات مقاومة المكورات العنقودية الذهبية كعامل أساسي في العدوى وتفشي المستشفيات ^4-8. الطرق الشائعة للاعتراف مقاومة المكورات، مثل القرص نشر أوكساسيلين أجار اختبار الشاشة، أو microdilution مرق، تعتمد على الظروف والثقافة مصممة لتعزيز التعبير عن المقاومة. وتشمل التعديلات الاستفادة من أوكساسيلين، الحضانة عند 30 أو 35 درجة مئوية بدلا من 37 درجة مئوية، وإدراج كلوريد الصوديوم إلى متوسطة النمو. وعلاوة على ذلك، للكشف عن الصحيح من خلال هذه الأنواع من التقنيات، وهي فترة حضانة طويلة من 24 ساعة بدلا من 16 إلى 18 ساعة هو مطلوب. تقنيات السريع مع المناسبة مستوى (> 96٪) من حساسية لتحديد مقاومة المكورات تشمل تقنيات microdilution الآلي مثل فيتيك GPS-SA بطاقة، ونظام العنقوديات ATB السريع، ونظام لوحة Microscan السريع التي تنتج النتائج بعد 3-11 ساعة ^9-11. كريستال M نظام ID RSA هي طريقة سريعة استنادا إلى الاعتراف نمو S. الذهبية في وجود كلوريد الصوديوم 2٪ و 4 ملغ من أوكساسيلين لكل لتر مع جهاز استشعار حساسة للأكسجين مضان. الحساسيات ادعى تتراوح بين 91-100٪ بعد 4 ساعات من الحضانة ^12-14. وهذه الأساليب المظهري محدودة في دقة من خلال تأثير السلالات السائدة التي تعبر عن المقاومة غير المتجانسة. ولذلك، فإن أفضل أساليب مقبولة على نطاق واسع للاعتراف مقاومة المكورات هو PCR أو تهجين الحمض النووي للجين MECA ^15. ولكن هذا الأسلوب يتطلب تنقية الحمض النووي وغير حساسة للغاية لالخلطات المختلفة (الشوائب)، والتي تشمل خلية الحطام ^16.

وعلاوة على ذلك، هذه التقنيات تحتاج وقتا طويلا لتنفيذها. ويمكن استخدام استراتيجيات للاعتراف للمنتج الجين MECA، البروتين PBP 2A، لتحديد المقاومة، وربما تكون أكثر موثوقية مقارنة مع تقنيات اختبار مستوى ^17.

<p clasق = "jove_content"> قد أظهرت في وقت سابق أن البكتيريا 12600 يمكن أن تستخدم بمثابة مسبار تقديرا لسلالات المكورات العنقودية الذهبية المقاومة بما فيها الدول التي ميثيسيلين ^1،2،18. في هذا العمل اقترحنا تقنية جديدة في الاعتراف محددة والكشف عن الجرثومة، مثل الاعتراف من البكتيريا جنبا إلى جنب مع التشكل من هذه الجرثومة في الوقت الحقيقي. لهذا الغرض محدد S. البكتيريا العنقودية الذهبية مع طائفة واسعة من المضيفين (بما في ذلك سلالات MRSA) جنبا إلى جنب مع الأضداد وحيدة النسيلة ضد بروتين (PBP 2A) وقد استخدمت. PBP 2A هو بروتين جدار الخلية وهذا هو سبب المقاومة للمضادات الحيوية MRSA من. ومع ذلك PBP الضد 2A ليس محددة لS. المكورات منذ بعض أنواع البكتيريا الأخرى لديها البروتينات ملزمة المضادات الحيوية مع تشابه تسلسل إلى PBP 2A ^19،20. ونتيجة لذلك في هذا العمل، S. وقد استخدمت البكتيريا العنقودية الذهبية وأجسام مضادة ضد بروتين PBP 2A. لتكون قادرة على وضع جهاز الاستشعار البيولوجي إلى specifiأتوماتيكيا كشف وتحديد MRSA جهاز مع وقد استخدمت إجراء من خطوتين. الخطوة الأولي استخدمت S. المكورات أحادي الطبقة البكتيريا باعتبارها دقق الاستشعار، في حين أن الخطوة الثانية يعمل PBP 2A أجسام مضادة محددة. ولذلك، خطوة واحدة سوف تعترف S. البكتيريا العنقودية الذهبية، وغيرها من واحد سوف تكون حساسة للبروتين مضاد حيوي ملزم. عندما الاشارات الواردة من خطوتين إيجابية، فإنه يشير إلى الكشف محددة من هذه الجرثومة.

Protocol

1. الأمر الذي يمهد الطريق الحصول على نوع السلالة S. المكورات آي تي سي سي 12600، S. المكورات آي تي سي سي 27690 والعصوية الرقيقة آي تي سي سي 6051. سلالات مقاومة للميثيسيلين من S. الذهبية – MRSA1، MRSA 2، MRSA 5، 13 MRSA، MRSA 26،…

Representative Results

أظهرت فج النشاط التحللي ضد جميع السلالات المختبرة من S. العنقودية الذهبية، بما في ذلك سلالات MRSA، كما يتبين من اختبار بقعة فج. وتراوحت أحجام البلاك عموما 5-15 ملم. ولم يتم العثور على النشاط ضد غيرها من الثقافات اختبار (الجدول 1). <p class="jove_content" style=";text-align:right;d…

Discussion

ومن المعروف جيدا أن فاجات يمكن استخدامها في تحقيقات جهاز الاستشعار البيولوجي لمسببات الأمراض البكتيرية ^28. ويتجلى ذلك في هذا العمل الذي فج جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة 2A PBP يمكن استخدامها لحل مشكلة قديمة: تمييز سلالات مقاومة للمضادات الحيوية والحساسة السريع….

Materials

			Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
			Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools