Биосенсоров для обнаружения устойчивых к антибиотикам бактерий Staphylococcus
Summary
Литические биосенсоров фага и антител шариков, способных различать устойчивые к метициллину (MRSA) и чувствительных бактерий стафилококка. Фаги обездвижен Ленгмюра-Блоджетт на поверхность кварцевых датчиков микровесах кристалла и работала широкая зонды стафилококком диапазоне. Антитела бисера признать MRSA.
Abstract
Структурно преобразован литических бактериофагов, имеющего широкий круг хозяев штаммов золотистого стафилококка и пенициллин-связывающих белков (ПСБ 2а) антитела, конъюгированного латексных были использованы для создания биосенсоров предназначен для дискриминации устойчивые к метициллину (MRSA) и чувствительные (MSSA) S . 1,2 золотистый вид. Литические фаги были преобразованы в фаг сфероидов при контакте с водой и хлороформом интерфейс. Фаговые сфероидом монослоя были перемещены на поверхности биосенсора Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ) техника 3. Созданный биосенсоров, были рассмотрены кварцевых микровесов с диссипацией слежения (QCM-D), чтобы оценить бактерий-фаг взаимодействий. Бактерии-сфероида взаимодействий привело к снижению резонансной частоты и увеличение диссипации энергии для MRSA и MSSA штаммов. После того, как бактериальный связывания, эти датчики были дополнительно подвергают пенициллин-связывающего белка антител латексный шарикс. Датчики проанализированы с MRSA ответил на PBP бисера 2а антител, хотя датчики проверены с MSSA не дал никакого ответа. Этот экспериментальный различие определяет однозначную дискриминации между метициллин устойчивый и чувствительный S. стафилококк штаммов. Не менее связанными и несвязанными бактериофаги подавляют рост бактерий на поверхностях и в воде суспензии. После литические фаги превратился сфероидами, они сохраняют свою сильную литической активностью и показывают высокую бактериальную возможности захвата. Фага и фаг сфероиды могут быть использованы для тестирования и стерилизации устойчивых к антибиотикам микроорганизмов. Другие приложения могут включать в себя использование в терапии бактериофаг и противомикробные поверхностей.
Introduction
Устойчивые к метициллину штаммы золотистого стафилококка были предложены в качестве фактора в необходимых инфекций и внутрибольничных вспышках 4-8. Обычные способы признания устойчивость к метициллину, такие как диск диффузии оксациллином кинопробы агар или бульон микроразведений, рассчитывать на индивидуальные условия культивирования для усиления экспрессии сопротивления. Изменения включают использование оксациллин, инкубация при 30 или 35 ° C, чем 37 ° С, и включение NaCl в среде роста. Кроме того, для правильного определения этих видов техники, длительный период инкубации 24 ч вместо 16 до 18 часов не требуется. Быстрое методы с соответствующим (> 96%) уровень чувствительности для идентификации устойчивость к метициллину включать автоматизированных методов микроразбавления такие как Vitek GPS-SA карты, Быстрое ATB Staph системы и быстрой панели Microscan системы, которые производят результаты после 3-11 часов 9-11. Кристалл MRSA ID системы является быстрое метод, основанный на признании роста S. стафилококк в присутствии 2% NaCl и 4 мг на литр оксациллин с чувствительных к кислороду флуоресценции датчика. Заявленное чувствительностью в диапазоне от 91 до 100% через 4 часа инкубации 12-14. Эти фенотипические методы ограничены в своей точности под воздействием распространенных штаммов, которые выражают гетерогенных сопротивления. Поэтому лучший широко принятыми методами для признания устойчивость к метициллину является ПЦР или гибридизации ДНК гена MÉCA 15. Однако этот метод требует очищенной ДНК и чрезвычайно чувствительны к различным примесей (примеси), которые включают 16 клеточного дебриса.
Кроме того, эти методы требуют длительного времени для выполнения. Стратегии, направленные на признание продукта Мека ген, белок PBP 2a, могут быть использованы для определения сопротивления и может быть более надежным по сравнению со стандартными методами тесте 17.
<p clasс = "jove_content"> Оно было ранее показано, что бактериофаг 12600 может быть использован в качестве зонда для признания золотистого стафилококка штаммы том числе те, метициллин сопротивление 1,2,18. В данной работе предложен новый метод в специфическое распознавание и обнаружение MRSA, такие как признание бактерии вместе с конформацией MRSA в реальном времени. Для этой цели С. стафилококк бактериофаг с широким спектром хозяев (включая штаммы MRSA) в сочетании с моноклональными антителами против белка (PBP 2a), были использованы. PBP 2a является белком клеточной стенки, и это является причиной сопротивления антибиотикам MRSA. Однако PBP 2a антитело не является специфичным для S. стафилококка, так как некоторые другие бактерии антибиотиками связывающих белков с последовательностью сходство с PBP 2a 19,20. Следовательно, в данной работе С. бактериофаг стафилококк и антитела против белка 2а PBP были использованы. Для того, чтобы разработать для биосенсора спецификациически обнаружения и идентификации MRSA устройство с двухступенчатым действием была использована. Первым шагом использованы С. стафилококк бактериофаг монослой как выходной сигнал с датчика, а на втором этапе используют PBP 2a специфических антител. Таким образом, первый этап будет признать С. стафилококк бактерии, а другая будет чувствителен к антибиотику-связывающий белок. Когда сигналы, получаемые от двух шагов положительны, указывает конкретный обнаружения MRSA.Protocol
Representative Results
Discussion
Хорошо известно, что фаги могут быть использованы в качестве зондов для биосенсора бактериальных патогенов 28. Как показано в этой работе, что фаг вместе с антителами PBP 2a может быть использован для решения старой проблемы: быстрое дискриминации устойчивых к антибиотикам и чувств?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Описываемой работе была поддержана грантами от Auburn University AUDFS и ВВС США CRADA 07-277-01-60MDG. Взгляды, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не отражают официальную политику или положения ВВС США, министерства обороны или американского правительства.
Materials
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| spectrophotometric-grade chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 154733 | (99.8% A.C.S.) |
| Hexane-Anhydrous | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 29609-0 | (95%) |
| Ethyl Alcohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT | 64-17-5 | 190 Proof |
| Equipment | |||
| PBP 2a antibody conjugated latex beads | Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan | The MRSA-Screen test | |
| S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from | American Type Culture Collection (Manassas, VA); | ||
| MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 | The culture collection of Auburn University, Auburn, AL | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K Ultra Centrifuge | |
| KSV 2200 LB film balance | KSV Chemicals, Finland | ||
| Light microscope optical system | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| QCM-D | Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden | E4 | |
| Scanning electron microscope (SEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL-7000F SEM | |
| Transmitting electron microscopy (TEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL, JEM 2010 | |
| Stericup, Presterilized | Millipore Corporation, Billerica, MA | SCGPU05RE | 0.22 μm, GP Express PLUS membrane |
| Bio-Assay dish | NUNC A/S, Denmark | 240835 | Dimensions(mm), 245 x 245 x 25 |
| Pipettes | Gilson, Pipetman, France | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific, CT | Classic C24 | |
| Gold-coated quartz pieces | Auburn University, AL | Homemade | |
| Petri dishes | Fisher Brand, USA | 0875713 | 100 mmX15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, ME | SG403 | |
| Culture Growing Flasks | Corning Incorporated, NY | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks |
| Optical Spectrometer | Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. | 4001 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma, USA | PDC-32G | |
| Millipore water purification system | Millipore | Direct-Q | |
| Imaging Ellipsometer | Accurion, USA | nanofilm_ep3se | |
| Software | Q-Sense AB, Sweden | QSoft, QTools |
References
- Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
- Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements. J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).
- Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films. Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).
- Barie, P. S. Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).
- Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).
- Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract. Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).
- Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. Methicillin resistant’ Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations. J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).
- Knopf, H. J. Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus. Urologe A. 36, 248-254 (1997).
- Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).
- Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).
- Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).
- Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of BBL crystal MRSA ID system. J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).
- Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System. J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).
- Zambardi, G., Fleurette, J., et al. European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).
- Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
- Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).
- Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).
- Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).
- Popham, D. L., Young, K. D. Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis. Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).
- Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH. J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).
- Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).
- Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).
- Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Rapid and sensitive biosensor for Salmonella. Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).
- Sauerbrey, G. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing. Z. Phys. 155, 206-222 (1959).
- Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
- Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface. Cell. 23, 747-753 (1981).
- Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces. Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Bioluminescent’ Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).
- Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. Missing mass” effect in biosensor’s QCM applications. Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).
- Gervals, L., Gel, M., et al. Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).
- Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption. Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).
- Sorokulova, I., Watt, J., et al. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).
- Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
