Summary
I de seneste år dannelsen af kønsceller brug af in vitro-dyrkningsmetoder er blevet demonstreret ved hjælp af flere forskellige typer af somatiske stamceller. Denne artikel vil visuelt præsentere differentieringen af nyfødte mus afledte stamceller til tidlige oocyt-lignende celler.
Abstract
Studere kønsceller dannelse og differentiering har traditionelt været meget vanskeligt på grund af lave celletal og deres placering dybt inde fostre. Tilgængeligheden af en "lukket" in vitro-baseret system kan vise sig uvurderlig for vores forståelse af gametogenese. Dannelsen af oocyt-lignende celler (OLCs) fra somatiske stamceller, isoleret fra nyfødte musehud, er påvist, og kan visualiseres i denne video protokol. De resulterende OLCs udtrykker forskellige markører i overensstemmelse med oocyter såsom Oct4, Vasa, Bmp15 og Scp3. Men de forbliver i stand til at undergå modning eller befrugtning på grund af en manglende færdiggørelse meiose. Denne protokol vil tilvejebringe et system, der er nyttig til at studere den tidlige fase dannelse og differentiering af kimceller i mere modne kønsceller. Under tidlig differentiering antallet af celler, der udtrykker Oct4 (potentielle kim-lignende celler) når ~ 5%, men i øjeblikket fsninger af OLCs fortsat relativt ineffektive. Protokollen er forholdsvis ligetil selvom særlig forsigtighed bør tages for at sikre, startende cellepopulation er sundt og på et tidligt passage.
Introduction
I den tidlige embryogenese sker gametogenese gennem en række faser, herunder oprindelige kønsceller (PGC) dannelse, migration og endelig kolonisering af de gonadale kamme. I løbet af denne tid PGC'er undergå proliferation og differentiering i stadig mere modne kønsceller 1.. Den omstændighed, at PGC'er migrere fra bunden af allantois i embryo hindgut og endelig langs den dorsale væg sidst koloniserede gonadale kamme gør dem ekstremt vanskeligt at studere 2. Trods fremskridt på området, har undersøgelser forsøger at forstå PGC dannelse og differentiering været hæmmet af deres begrænsede antal, placering og vandrende art 3,4.
I de seneste år embryonale stamceller har vist sig at have potentiale til at danne kimceller in vitro 5,6. Ligeledes har flere somatiske stamceller også vist sig at have potentiale til at danne kønsceller Follgrund in vitro dyrkning 7-11. For nylig stamceller isoleret fra nyfødte musehud blev differentieret in vitro i kim-lignende celler og nyuddannede oocytter 12. Under differentiering den delmængde af stamcellerne udtrykker Oct4 steg og strukturer ligner cumulus-oocyt-komplekser blev dannet. Ægget-lignende celler (OLCs) kan plukkes fra kulturer, og i forhold til naturlige oocytter. Brug af denne dyrkningsmetode OLCs måler 40-45 um opnås som udtrykker lignende markører til oocytter såsom Gdf9b, VASA og DAZL. Til dato de resulterende OLCs forbliver ude af stand til at modne eller blive befrugtet 12..
Selvom OLCs forbliver i stand til at fungere den protokol, der bruges til at danne disse OLCs stadig kan have nytte som et assay til at studere dannelsen og udviklingen af tidligere stadier kønscellerne i en lukket in vitro-system. Den originale publikation diskuterer dannelsen af OLCs fra, såmatic stamceller udnyttet føtal svinehud som en stamcelle kilde 8.. Udvidelse på denne undersøgelse af PGC-lignende celler dannet tidligt i induceret differentiering viste sig at være forstadier til OLCs og ekspres sådanne PGC markører som OCT4, VASA, STELLA, C-KIT og DAZL 13.. Disse data understøtter potentialet for at udnytte dette system til at studere kimcelle dannelse og differentiering in vitro. Protokollen anvendes til dannelse OLCs fra nyfødt mus hud vil blive demonstreret i denne video artiklen. Denne protokol giver en in vitro model til at studere kim celle udvikling, der kan give et middel til at belyse faktorer vigtige for deres proliferation og differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Medier Forberedelse
- Forbered medier 2-3 hr forud for brug og sted med en løsnet hætte i cellekultur inkubator hvor forsøget vil finde sted. Medier, der anvendes i den nuværende protokol:
- Forbered stamcelle medium bestående af DMEM/F12 suppleret med 1 x B27, 40 ng / ml bFGF og 20 ng / ml EGF.
- Forbered kim celledifferentiering medium bestående af M199 suppleret med 0,05 IU FSH 0,03 IU LH, 3 mg / ml BSA, 5 ul / ml ITS, 0,23 mM natriumpyruvat, 1 mg / ml fetuin, og 1 ng / ml EGF. En base medium bestående af alle tilsætningsstoffer men uden FSH kan LH og EGF fremstilles og opbevares ved 4 ° C i op til en uge.
2.. Stem Cell Culture Forberedelse
- Isolere stamceller fra nyfødte museungers som tidligere beskrevet 12.. Udnyt stamceller ved passage 2-4 til in vitro kimcellens differentiering. Effektiviteten afOLC dannelse er direkte relateret til kvaliteten af de startende stamceller. Det er bedst at starte differentieringen så snart befolkningen synes rent og sundt som er generelt på omkring kanalen 2. Yderligere dyrkning af stamceller forløbne passage 2 negativt påvirker OLC formation virkningsgrad (upublicerede resultater).
- 48 hr før initiering differentiering subkultur stamceller. Fjern alle de suspenderede sfæriske celleaggregater og brugte medier fra dyrkningsskålen, ved hjælp af en serologisk pipette, og anbring dem i et 15 ml rør. Det er vigtigt kun at indsamle de suspenderede sfæriske aggregater af celler og ikke de celler knyttet til bunden af skålen, der spontant differentiere.
- Pellet cellerne ved 500 xg i 5 min., Supernatanten, og resuspender i 500 pi frisk stamceller medier opvarmet til 37 ° C. Pipettér forsigtigt aggregaterne til delvis dissociere cellerne. Må ikke aggressivt pipettere cellens, da dette vil reducere cellernes levedygtighed. Vask delvist dissocierede celler i 9,5 ml frisk forvarmet stamcelle medium på en lav tilknytning 10 cm celledyrkningsskål.
- Returnere cellerne til et 37 ° C, 5% CO 2 cellekultur inkubator i 48 timer før initiering af differentiering.
3.. OLC Differentiering
- Ved hjælp af en serologisk pipette fjerne stamceller fra kulturen fad og sted i en 15 ml rør, efterlader eventuelle tilsluttede celler. Pellet cellerne ved 500 x g og resuspender i 500 pi sterilt PBS. Kraftig pipette cellerne ved hjælp af en bred boring 1.000 pi spids i klumper ikke større end 10-20 celler. Periodisk fjerne en lille mængde af celler, under dissociation, og tjek under et hvidt lys mikroskop for at bekræfte aggregerede celler er i klumper af 10-20 individuelle celler. Over dissociation vil resultere i nedsat cellelevedygtighed.
- Tilføj 9,5 ml PBS til de dissocierede celler og tilsæt 15 pi af denne cellesuspension til et hæmocytometer til celletælling. Pellet cellerne ved 500 xg i 5 min.
- Genopslæmmes cellerne i en koncentration på 1.32X10 6 celler / ml i differentiering medium.
- Plate cellerne ved tilsætning 500 pi per brønd i en fladbundet 24 brønde suspension skålen.
- Placer 24 godt fadet i en cellekultur inkubator ved 37 ° C i 5% CO2 i 48 timer. Fjern 250 gl medium fra hver brønd og anbringes i en tilsvarende mærket 1,5 ml rør. Tilsæt 250 pi frisk differentiering medium til hver brønd. Centrifugeres brugte medium ved 500 xg i 5 min. og supernatanten. Resuspender eventuelle pelleterede celler i 50 pi frisk differentiering medium og vende tilbage til den tilsvarende kultur godt på differentiering plade.
- Hver 48 hr ændre halvdelen af mediet op til dag 12 i differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oprindeligt cellerne tillægger dyrkningsskålen bunden og spredt ud. Ved 42-72 hr i differentiering små suspenderede OCT4 positive celler dannes og formere (figur 1A). Kort efter visualisering af disse celler flertallet vil forsvinde og de vedhæftede celler vil danne tætte koloni aggregater på kulturen bunden. Efter et par dage disse aggregater vil løsne sig fra den kultur overflade. I nogle af disse aggregater en stor celle kan observeres (figur 1b og 1c). Ved første visualisering af cellerne vil være ~ 35 um i diameter. Med fortsat dyrke OLCs vil vokse for at nå ~ 45 um i diameter. Det er de OLCs og kan opsamles med bæreceller eller trypsineres at opnå OLCs uden andre celler knyttet (figur 1d).
For at bekræfte, at de OLCs udtrykker lignende afskrifter som naturlige oocytter de OLCs kan opsamles og testes forekspressionen af sådanne markører som ZPC, Scp3, CMOS, Oct4, Bmp15 og Vasa. Mens Oct4 og Vasa er udtrykt i de udifferentierede stamceller flere markører, såsom Bmp15 og ZPC er oocyt specifikke. BMP15 er et medlem af TGF-β familien og er involveret i ægcelle og follikeludvikling. Oocytten specifikke æggeskallen membran struktur består af flere proteiner, herunder ZP3. Ekspressionen af disse oocyt specifikke markører kan anvendes til at bekræfte tilstedeværelsen af OLCs i differentiering. Endvidere kan ekspressionen af meiotiske specifikke markører, såsom Scp3 og CMOS identificere potentielt meiotiske celler i kultur-systemet. I eksemplet billede 10 OLCs og 10 oocytter blev indsamlet og direkte cDNA-syntese udført (figur 2). De resulterende prøver blev dernæst testet ved hjælp af semi-kvantitativ PCR. Sammenligning af ekspression af disse markører til naturlige mus oocytter vi serforskelle i niveauerne af transkripter (figur 2). Mange markører udtrykt af oocytter vil blive udtrykt ved OLCs hvis differentieringen var vellykket.
Figur 1. Fælles morfologier løbet induceret differentiering af hudens afledt stamceller. a) I den tidlige fase differentiering celler positive for OCT4 (grøn) kan påvises i kulturen. Nucleuses er counter farves med Hoechst (blå). B) Så differentiering skrider nogle celleaggregater vil blive set med OCT4 (grøn) positive celler omgivet af OCT4 negative celler. Nuklear farvning med Hoechst også afbildet (blå). C) Et hvidt lys billede af en follikel-lignende struktur efter frigørelse fra kultur overflade. D) I differentiation store OCT4 positive (grøn) oocyt-lignende celler kan ses enten omgivet af celler eller enkeltvis i kulturen. Skalapanelerne: a = 20 um, b = 100 um, c = 40 um, d = 10 um.
Figur 2. Transcript niveau OLCs, sammenlignet med oocytter, af almindelige oocyt markører. Repræsentative real time PCR resultater, som viser udskrift niveau af fælles oocyt markører i OLCs. Denne sammenligning er resultatet af 10 oocyt-lignende celler at blive sammenlignet med 10 nyfødte mus oocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til dato funktionelle OLCs ikke er blevet udviklet ved hjælp af en helt in vitro-assay. For nylig en undersøgelse af Hayashi et al. Var i stand til at producere afkom fra PGC-lignende celler dannet in vitro og overført in vivo til videreudvikling 14.. Startende med ES-celler eller induceret pluripotente celler, de var i stand til at danne PGC lignende celler, som, når inddrevne efter in vivo transplantation kunne blive modnet, befrugtet, og bruges til at generere afkom 14.. Dette viser, at stamceller fra forskellige kilder har potentiale under de rette betingelser, til at danne funktionelle oocytter.
Visse aspekter af dyrkningssystemet er afgørende for det fungerer. Den stamme af mus anvendes til at isolere stamceller er meget vigtigt. Denne protokol blev udviklet og anvendt med B6 mus fra Jackson Lab (Stock # 008.214). Disse mus bærer en Oct4-EGFP transgen tillader forholdualization af celler, der udtrykker Oct4 via EGFP proteinet. Da protokollen blev forsøgt ved hjælp af stamceller fra CD1 mus effektiviteten var meget lavere og OLC formation var mindre pålidelige. I øjeblikket effektiviteten af OLC dannelse forbliver lav, selv når du bruger B6 mus. De stamceller pågældende celler skal være passage 2-4 før initiering kønsceller differentiering effektiviteten af kønsceller dannelse er meget lavere, når du bruger senere passage celler. Kilden til forskellige reagenser har også vist sig at være vigtig.
Analysen af de forskellige mRNA-transkripter i OLCs kan vise sig nyttige i at optimere dyrkningssystemet. Brug semi-kvantitativ PCR muliggør sammenligning af flere markører ekspressionsniveauer mellem OLCs og oocytter (figur 2). Resultaterne viser, at OLCs udtrykker mindre ZPC end oocytter, hvilket kan forklare den skrøbelige natur og tyndere æggeskallen membran af OLCs. Udtryk for meiosen markør
Protokollen beskrevet her tilvejebringer en kontrolleret in vitro metode til at studere kimcelle dannelse og differentiering. I øjeblikket PGC-lignende genereret celler er i stand til at danne funktionelle OLCs når opretholdt in vitro. Når aggregerede med nyfødte ovarie somatiske celler og transplanteres in vivo de PGC-lignende celler er i stand til at danne den tidlige fase sekundære follikler. Men når OLCs inddrives de stadig ude af stand til pålideligt modnet og befrugtet 12.. Anvendeligheden i dette assay kommer fra studere præ-meiotiske kønsceller afledt fra somatiske stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
PWD understøttes af en canadisk Institutes of Health Research Fellowship (CIHR) og en CIHR tilskud til Gerald M. Kidder på Western University. Forfatteren vil også gerne anerkende Julang Li på University of Guelph om hjælp med udviklingen af protokollen, der præsenteres her.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27 (2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339 (2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263 (2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
