الرقمية المضمنة المجسم مجهرية (DIHM) من الموضوعات وكلي نثر
Summary
المواقع الثلاثة الأبعاد للأجسام نثر ضعيفة ويمكن تحديدها بشكل فريد باستخدام مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM)، والذي ينطوي على تعديلات طفيفة على المجهر القياسية. برنامجنا يستخدم ارشادي التصوير بسيطة إلى جانب رايلي-سمرفلد العودة الانتشار لانتاج موقف ثلاثي الأبعاد والهندسة لكائن المرحلة المجهرية.
Abstract
كائنات نثر ضعيفة، مثل الجسيمات الغروية الصغيرة ومعظم الخلايا البيولوجية، كثيرا ما واجه في المجهر. في الواقع، تم تطوير مجموعة من التقنيات لتصور أفضل هذه الكائنات المرحلة؛ الطوري ومدينة دبي للإنترنت هي من بين الأساليب الأكثر شعبية لتعزيز التباين. ومع ذلك، وتسجيل موقف والشكل في الاتجاه خارج التصوير الطائرة لا تزال صعبة. يقدم هذا التقرير المنهج التجريبي بسيطة لتحديد دقيق لمكان وهندسة الكائنات في ثلاثة أبعاد، وذلك باستخدام المجهر مضمنة الرقمية الثلاثية الأبعاد (DIHM). بشكل عام، يتم تعريف حجم العينة الوصول إليها عن طريق حجم مستشعر الكاميرا في الاتجاه الجانبي، وتماسك الإضاءة في الاتجاه المحوري. وتتراوح أحجام عينة نموذجية من 200 ميكرون × 200 ميكرون × 200 ميكرون باستخدام الإضاءة LED، ل5 مم × 5 مم × 5 مم أو أكبر باستخدام إضاءة الليزر. يتم تكوين هذا الضوء الإضاءة بحيث موجات الطائرة هي الحادثة على العينة. الكائنات في حجم العينة ثم تبعثر الضوء، والتي تتعارض مع ضوء unscattered لتشكيل أنماط التدخل عمودي على اتجاه الإضاءة. هذه الصورة (الهولوغرام) يحتوي على المعلومات المطلوبة لإعادة الإعمار عمق ثلاثي الأبعاد، ويمكن أن يتم القبض على جهاز التصوير القياسية مثل CMOS أو كاميرا CCD. يعمل على رايلي-سمرفلد طريقة الانتشار مرة أخرى إلى إعادة تركيز عدديا الصور المجهر، والكشف عن مجريات الأمور التصوير البسيط القائم على المرحلة GOUY الشذوذ يستخدم لتحديد نثر الكائنات ضمن حجم أعيد بناؤها. النتائج هذه الطريقة بسيطة ولكنها قوية في لا لبس فيها، خالية من نموذج قياس موقع وشكل الأشياء في عينات مجهرية.
Introduction
مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM) يسمح بسرعة التصوير ثلاثي الأبعاد للعينات مجهرية، مثل الكائنات الحية الدقيقة السباحة 1،2 و 3،4 أنظمة المسألة لينة، مع الحد الأدنى من التعديل لإعداد المجهر القياسية. في هذه الورقة يتم توفير مظاهرة تربوية من DIHM، تتمحور حول برنامج تم تطويره في المختبر. وتشمل هذه الورقة وصفا لكيفية إعداد المجهر، وتحسين الحصول على البيانات، ومعالجة الصور المسجلة لإعادة بناء البيانات ثلاثية الأبعاد. برنامج (مقرها في جزء منه على البرامج التي وضعتها المديرية العامة جرير وغيرهم 5) والمثال الصور هي متاحة بحرية على موقعنا. ويرد وصف الخطوات اللازمة لتكوين المجهر، وإعادة بناء ثلاثة مجلدات الأبعاد من الصور المجسمة وتقديم وحدات التخزين الناتجة من الاهتمام باستخدام شعاع الحرة تتبع حزمة البرامج. تخلص الورقة مع مناقشة العوامل التي تؤثر على جودة إعادة الإعمار، ومقارنة مع طرق DIHM المتنافسة.
على الرغم من DIHM وصفت منذ بعض الوقت (لاستعراض عام للمبادئ وتطورها، انظر كيم 6)، والقدرة الحاسوبية المطلوبة وصورة الخبرة تجهيز وحتى الآن تقتصر إلى حد كبير استخدامه لمجموعات بحثية متخصصة مع التركيز على تطوير الصك. هذا الوضع يتغير في ضوء التطورات الحديثة في مجال الحوسبة والتكنولوجيا الكاميرا. يمكن لأجهزة الكمبيوتر المكتبية الحديثة التعامل بسهولة مع تجهيز ومتطلبات تخزين البيانات؛ CCD أو CMOS الكاميرات موجودة في معظم مختبرات الفحص المجهري، وتبذل البرنامج المطلوبة متاحة بحرية على شبكة الانترنت من قبل الجماعات الذين استثمروا الوقت في تطوير هذه التقنية.
وقد اقترحت عدة مخططات لتصوير تكوين الكائنات المجهرية في حجم العينة ثلاثية الأبعاد. العديد من هذه التقنيات يتم مسح 7،8، والتي يتم تسجيلها في كومة من الصور عن طريق مترجمة echanically الطائرة الصورة من خلال العينة. المسح المجهري متحد البؤر مضان وربما كان المثال الأكثر دراية. عادة، يتم إضافة صبغة الفلورسنت إلى كائن المرحلة من أجل تحقيق مستوى مقبول من عينة النقيض من ذلك، وترتيب متحد البؤر تستخدم لتوطين مكانيا الانبعاثات الفلورسنت. وقد أدى هذا الأسلوب إلى تقدم كبير، على سبيل المثال في العلوم الغروي، حيث سمح لها الوصول إلى ديناميكية ثلاثية الأبعاد للأنظمة مزدحمة 9-11. استخدام الوسم هو الفرق المهم بين المجهري متحد البؤر مضان وDIHM، ولكن ميزات أخرى من التقنيات اثنين تستحق المقارنة. DIHM لديه ميزة سرعة كبيرة في هذا الجهاز ليس لها أجزاء متحركة. المرايا المسح الميكانيكية في أنظمة متحد البؤر وضع حد أعلى لمعدل الحصول على البيانات – عادة حوالي 30 لقطة / ثانية للحصول على صورة بكسل 512 X 512. وتستخدم مجموعة من مثل هذه الصور من طائرات التنسيق المختلفة التي يمكن أن يحصل عليها جسديا translating المرحلة عينة أو عدسة الهدف بين الإطارات، مما أدى إلى معدل التقاط النهائية حول حجم واحد في الثانية لمدة 30 إطار المكدس. في المقابل، يمكن لنظام الثلاثية الأبعاد استنادا على كاميرا CMOS الحديثة التقاط 2،000 لقطة / ثانية في نفس حجم الصورة والقرار؛ تتم معالجة كل إطار `حاليا 'لإعطاء لقطة مستقلة من حجم العينة. أن أكرر: ليس مطلوبا من عينات الفلورسنت لDIHM، على الرغم من أن النظام تم تطويره الذي ينفذ إعادة الإعمار الثلاثية الأبعاد للموضوع الفلورسنت 12. فضلا عن معلومات وحدة التخزين ثلاثي الأبعاد، DIHM يمكن أن تستخدم أيضا لتوفير الكمية المرحلة على النقيض من الصور 13، ولكن هذا خارج نطاق المناقشة هنا.
الصور DIHM البيانات الخام هي ثنائية الأبعاد، وفي بعض النواحي تبدو وكأنها صور المجهر القياسية، وإن كان خارج التركيز. والفرق الرئيسي بين DIHM ومعيار المجهر حقل مشرق يكمن في حلقات حيود التي تحيط الأجسام طن مجال الرؤية، وهذه هي نتيجة لطبيعة الإضاءة. يتطلب DIHM مصدر أكثر تماسكا من حقل مشرق – عادة ما يكون LED أو ليزر. حلقات حيود في صورة ثلاثية الأبعاد تحتوي على المعلومات الضرورية لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد. هناك نوعان من الأساليب الرئيسية لتفسير البيانات DIHM؛ المباشر المناسب وإعادة تركيز العددية. النهج الأول هو المعمول بها في الحالات التي يعرف الشكل الرياضي للنمط حيود مقدما 3،4؛ يتحقق هذا الشرط من قبل حفنة صغيرة من أشياء بسيطة مثل المجالات، واسطوانات، والعقبات نصف الطائرة. تركيب المباشرة ينطبق أيضا في الحالات التي يعرف الموقف المحوري للكائن، والصورة يمكن تركيبها باستخدام ننظر إلى أعلى الجدول من القوالب صورة 14.
النهج الثاني (إعادة تركيز العددية) بل هي أعم وتعتمد على استخدام حلقات حيود في صورة ثلاثية الأبعاد ثنائي الأبعاد لإعادة بناء المجال البصري عدديا فيعدد من طائرات التنسيق (متباعدة بشكل تعسفي) في جميع أنحاء حجم العينة. توجد العديد من الطرق ذات الصلة للقيام بذلك 6؛ يستخدم هذا العمل رايلي-سمرفلد الظهر تقنية إكثار كما وصفها لي وجرير 5. نتائج هذا الإجراء هو كومة من الصور التي تحاكي تأثير تغيير البؤري المجهر (ومن هنا جاء اسم `إعادة تركيز العددية ') يدويا. مرة واحدة تم إنشاؤها كومة من الصور، يجب الحصول على موقف من هذا الموضوع في الحجم البؤري. ، وقد تم عرض عدد من الاستدلال تحليل الصور، مثل التباين كثافة المحلية أو محتوى التردد المكاني لتحديد من حدة التركيز في نقاط مختلفة في العينة 15. في كل حالة، عندما يتم تكبير الصورة متري معين (أو التقليل منها)، ويعتبر الكائن ليكون في التركيز.
خلافا لغيرها من البرامج التي تسعى إلى تحديد المستوى البؤري خاص حيث هو كائن "في التركيز"، وطريقة في هذا العمل يختار من عoints التي تقع داخل الكائن من الفائدة، والتي قد تمتد عبر مجموعة واسعة من طائرات التنسيق. هذا النهج ينطبق على طائفة واسعة من المواضيع ومناسبة خاصة للمدد، وعينات من نثر ضعيفة (كائنات المرحلة)، مثل الغرويات على شكل قضيب، وسلاسل من البكتيريا أو سياط حقيقية النواة. في مثل هذه العينات يغير الصورة النقيض عندما يمر جسم من خلال البؤري؛ صورة امتبائر بها مركز الضوء إذا كان الكائن على جانب واحد من الطائرة ومركز التنسيق الظلام إذا كان من جهة أخرى. كائنات مرحلة نقية ليس لديهم أي النقيض عندما تقع بالضبط في المستوى البؤري. وقد تمت مناقشة هذه الظاهرة من انعكاس على النقيض من قبل مؤلفين آخرين 16،17 هو في نهاية المطاف وبسبب المرحلة GOUY الشذوذ 18. وقد تم وضع هذا على أساس أكثر صرامة في سياق تصوير ثلاثي الأبعاد في أي مكان آخر، حيث يتم تقييم حدود التقنية، وعدم اليقين في موقف نموذجي هو من أجل من 150 نانومتر (ما يقرب من واحد بكسل) في مجموعة شرق افريقياح 19 اتجاه. على طريقة GOUY مرحلة الشذوذ هو واحد من عدد قليل من مخططات DIHM واضحة المعالم لتحديد بنية الكائنات الموسعة في ثلاثة أبعاد، ولكن مع ذلك بعض الكائنات هي إشكالية لإعادة بناء. الكائنات التي تقع مباشرة على طول المحور البصري (مشيرا في الكاميرا) يصعب إعادة بناء بدقة؛ الشكوك في طول وموضع الكائن تصبح كبيرة. هذا القيد هو في جزء منه نتيجة لعمق بت محدود من وحدات البكسل تسجيل الهولوغرام (عدد مستويات الرمادي المتميزة التي يمكن أن تسجل الكاميرا). يحدث التكوين إشكالية أخرى عند موضع اهتمام هو قريب جدا من المستوى البؤري. في هذه الحالة، يتم بناؤها الصور الحقيقية والافتراضية للكائن على مقربة، مما أدى إلى الحقول البصرية المعقدة التي يصعب تفسيرها. ثانيا، والقلق قليلا أقل أهمية هنا هو أن هامش حيود الناتجة تشغل أقل من صورة الاستشعار، وهذا الوقود النووي المشع الحبيبات الخشنةormation يؤدي إلى إعادة بناء ذات جودة الفقيرة.
في الممارسة العملية، يتم تطبيق مرشح التدرج إلى وحدات تخزين بسيطة أعيد بناؤها ثلاثي الأبعاد للكشف عن ظاهرة الانقلاب كثافة قوية على طول اتجاه الإضاءة. المناطق التي يتغير بسرعة شدة من الضوء إلى الظلام، أو العكس، ثم يتم المرتبطة المناطق نثر. موصوفة جيدا الأجسام نثر ضعيفة، كمجموعة noninteracting من هذه العناصر 20، وهذه المساهمات الفردية المبلغ لإعطاء مجموع الحقل متناثرة الذي هو مقلوب بسهولة باستخدام رايلي-سمرفلد أسلوب ظهر الانتشار. في هذه الورقة، يتم تطبيق كثافة المحوري تقنية الانحدار إلى سلسلة من الخلايا العقدية. أجسام الخلايا هي كائنات المرحلة (الأنواع كولاي ديها معامل الانكسار قياس 21 ليكون 1.384 في الطول الموجي λ = 589 نانومتر؛ من المرجح أن تكون مماثلة سلالة العقدية) وتبدو وكأنها سلسلة عالية الكثافة من النقط المتصلة في اله حجم العينة بعد التصفية التدرج تم تطبيقه. عتبة وميزة أساليب الاستخراج القياسية المطبقة على وحدة التخزين هذه تصفيتها تسمح استخراج بكسل الحجمي (voxels) المقابلة لمنطقة داخل الخلايا. وهناك ميزة خاصة لهذا الأسلوب هو أنه يتيح إعادة الإعمار لا لبس فيه من موقف كائن في الاتجاه المحوري. أساليب مماثلة (على الأقل، وتلك التي الهولوغرام سجل على مقربة من وجوه، من خلال تصويرها الهدف المجهر) يعانون من عدم القدرة على تحديد علامة على هذا النزوح. على الرغم من أن طريقة إعادة الإعمار رايلي-سمرفلد هو أيضا التوقيع مستقلة في هذا المعنى، فإن عملية التدرج يتيح لنا أن تميز بين الكائنات المرحلة ضعيفة فوق وتحت المستوى البؤري.
Protocol
Representative Results
Discussion
أهم خطوة في هذا البروتوكول التجريبي هو التقاط دقيقة من الصور من الإعداد التجريبية مستقرة. مع البيانات الأساسية الفقراء والتعمير الدقة العالية هو أقرب إلى المستحيل. من المهم أيضا لتجنب العدسات الهدف مع عنصر النقيض من المرحلة الداخلية (مرئية كما بالطوق الظلام عندما ت?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
والمؤلفان بالشكر ليندا تيرنر للمساعدة في إعداد الميكروبيولوجية. وتم تمويل RZ وLGW من قبل معهد رولاند في جامعة هارفارد وCGB كما تم تمويل مؤسسة عالم الرؤوس، والعلوم بلا حدود البرنامج، البرازيل (عملية # 7340-11-7)
Materials
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon Corp. | ||
| LED | Thorlabs | M660L3 | emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm |
| LED power supply | Thorlabs | LEDD1B | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM2T2 | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM1A2 | |
| Frame Grabber board | EPIX | PIXCI E4 | |
| High-Speed CMOS camera | Mikrotron | MC-1362 |
References
- Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. Digital in-line holography for biological applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).
- Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).
- Lee, S. H., Roichman, Y., et al. Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy. Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).
- Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy. Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).
- Lee, S. H., Grier, D. G. Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures. Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).
- Kim, M. Principles and techniques of digital holographic microscopy. SPIE Rev. 1, 018005 (2010).
- Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. Tracking sperm in three-dimensions. Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).
- Santi, P. Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review. J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- van Blaaderen, A., Wiltzius, P. . Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).
- Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear. Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).
- Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses. Science. 318, 1895-1899 (2007).
- Rosen, J., Brooker, G. Fluorescence incoherent color holography. Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).
- Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy. Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).
- Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical. J. Vis. Exp. 34, (2009).
- Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl. Opt. 47 (19), (2008).
- Elliot, M. S., Poon, W. C. K. Conventional optical microscopy of colloidal suspensions. Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).
- Born, M., Wolf, E. . Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).
- Wilson, L., Zhang, R. 3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation. Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).
- Bohren, C., Huffman, D. . Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).
- Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. Refractive index of escherichia coli cells. Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).
- Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria. Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).
- Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. Digital in-line holographic microscopy. Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).
- Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform. Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).
- Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence. Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).
- Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers. Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).
- Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source. Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).
- Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed. Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).
- Berg, H. C., Brown, D. A. Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking. Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).
- Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy. Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).
