弱散乱被験者のデジタルインラインホログラフィ顕微鏡（DIHM）

Summary

弱散乱物体の三次元位置が一意的に標準的な顕微鏡に軽微な改変を伴うデジタルインラインホログラフィック顕微鏡法（DIHM）を用いて同定することができる。当社のソフトウェアは、微細な位相物体の3次元位置と形状を得るためにレイリー·ゾンマーフェルトバックプロパゲーションと相まって、簡単な画像処理、ヒューリスティックを使用しています。

Abstract

このような小さなコロイド粒子であり、最も生物細胞のような弱散乱オブジェクトは、しばしば顕微鏡法で遭遇する。実際に、技術の範囲は、これらのより良好な位相物体を可視化するために開発されている。位相コントラストおよびDICは、コントラストを増強するための最も一般的な方法の一つである。しかしながら、外撮像面内方向の記録位置や形状が困難なままである。このレポートには、正確にデジタルインラインホログラフィ顕微鏡（DIHM）を使用して、場所と3次元のオブジェクトの形状を決定するための簡単​​な実験方法を紹介します。大まかに言えば、アクセス可能なサンプル容量を、横方向にカメラセンササイズ、および軸方向に、照明のコヒーレンスによって定義される。典型的なサンプル量は、LED照明を使用して200 ミクロン ×200 ミクロン ×200ミクロンから、の範囲レーザ照射を用いて5 ミリメートル×5mm角以上である。平面波が試料に入射するように、この照明光は、構成されている。サンプル容積内のオブジェクトは、次いで、照明方向に垂直な干渉パターンを形成する非散乱光と干渉する、光を散乱する。この画像（ホログラム）は、3次元再構成に必要な奥行き情報を含み、例えば、CMOSまたはCCDカメラなどの標準的な撮像素子上に撮像することができる。バックレイリー·ゾンマーフェルト伝搬法を数値顕微鏡画像をリフォーカスするために使用され、グイ位相に基づいて単純な撮像ヒューリスティックは、異常再構成されたボリューム内の散乱物体を識別するために使用される。このシンプルでありながら堅牢な方法は、顕微鏡の試料内のオブジェクトの位置や形状の明確な、モデルフリー測定、その結果。

Introduction

デジタルインラインホログラフィ顕微鏡法（DIHM）は、標準的な顕微鏡のセットアップへの最小限の変更で、微生物^1,2とソフト物質系^3,4水泳などの微細なサンプルを迅速に3次元画像化することができます。本論文ではDIHMの教育的なデモは、当社の研究室で開発されたソフトウェアを中心に、提供されています。本稿では、顕微鏡のセットアップデータの取得を最適化し、3次元データを再構成するために記録画像を処理する方法の説明が含まれています。ソフトウェア（DGグリアら⁵によって開発されたソフトウェアに一部基づいて）および実施例の画像は、当社のウェブサイト上で自由にご利用いただけます。説明は、顕微鏡を構成するホログラムから三次元ボリュームを再構成し、ソフトウェアパッケージのトレース自由線を用い、目的の結果としてのボリュームをレンダリングするのに必要なステップが設けられている。論文は、再構成の品質に影響を与える要因についての議論で締めくくりと競合する方法とDIHMの比較。

DIHMが（キム^6を参照して、その原則と発展の全般的なレビューのために）いくつかの時間前に説明したが、必要な演算能力と画像処理の専門知識は、これまで主に、機器の開発を中心とした専門家の研究グループに、その使用を制限している。この状況は、コンピューティングおよびカメラ技術における最近の進歩に照らして変化している。近代的なデスクトップコンピュータを簡単に処理し、データストレージ要件に対応できる、CCDまたはCMOSカメラは、ほとんどの顕微鏡ラボに存在し、かつ、必要なソフトウェアは、技術の開発に時間を投資しているグループが、インターネット上で自由に利用できるようにされています。

様々なスキームは、三次元試料体積に微視的オブジェクトの構成を撮像するために提案されている。これらの多くは、画像のスタックがmで記録された技術は^7,8、スキャンするechanically試料を通って像面の翻訳。共焦点蛍光顕微鏡をスキャンすると、おそらく最も身近な例である。典型的には、蛍光染料は、サンプルコントラストの許容レベルを達成するために、位相物体に添加し、共焦点配置は、空間的に蛍光発光を局在化するために使用される。この方法は、混雑したシステム^9-11の三次元ダイナミクスへのアクセスを許可しているコロイド科学において、例えば有意な進歩をもたらした。ラベルの使用は、蛍光共焦点顕微鏡とDIHMの重要な違いですが、2つの技術のその他の特徴は、比較する価値があります。 DIHMは装置が可動部品を持たないという点で重要な速度の利点を持っています。共焦点システムにおける機械的な走査ミラーは、データ取得速度に上限を置く – 512×512ピクセルの画像のための、典型的には約30フレーム/秒。異なる焦点面からのような画像のスタックは、物理的に：訳で得ることができる30フレームスタック毎秒約1ボリュームの最終的な捕捉率につながる、フレーム間の試料ステージや対物レンズating。比較において、現代のCMOSカメラに基づいて、ホログラフィシステムは、同じ画像サイズと解像度で2000フレーム/秒をキャプチャすることができ、各フレームはサンプルボリュームの独立したスナップショットを与えるためにオフライン `'を処理する。繰り返しになります。システムは、蛍光被写体¹²のホログラフィック再構成を実行するように開発されてきたが、蛍光サンプルは、DIHMには必要ありません。ならびに三次元ボリューム情報は、DIHMも定量的位相コントラスト画像^13を提供するために使用することができるが、それは、ここでの議論の範囲外である。

生DIHMデータ画像は2次元であり、いくつかの点で、焦点の外ではあるが、標準的な顕微鏡画像のように見える。 DIHM標準明視野顕微鏡の主な違いは、オブジェクトを囲む回折リングにあるInの視野は、これらは、照明の性質によるも​​のである。一般的に、LEDまたはレーザー – DIHM明視野よりも多くのコヒーレント光源を必要とします。ホログラムの回折リングは、三次元画像を再構築するために必要な情報が含まれている。ダイレクトフィッティングと数値リフォーカシング; DIHMデータを解釈するには、2つの主要なアプローチがあります。最初のアプローチは、回折パターンの数学的形式が予め^3,4において知られている場合においても適用可能であり、この状態は、球、円柱、および半平面上の障害のような単純なオブジェクトの一握りによって満たされる。直接フィッティングはまた、オブジェクトの軸方向の位置が既知である場合に適用され、画像は、画像テンプレート¹⁴のルックアップテーブルを用いて取り付けることができる。

第二のアプローチ（数字リフォーカス）がむしろ一般的であり、数値的に光場を再構成するために、二次元画像のホログラム回折リングを使用に依存しているサンプル量全体（任意間隔）フォーカルプレーンの数。いくつかの関連するメソッドは、この^6を行うために存在し、リーとグリア⁵で説明したように、この作品は、バックプロパゲーション法をレイリー·ゾンマーフェルトを使用しています。この手順の結果は、手動で顕微鏡の焦点面（名前の由来 `数値リフォーカシング '）を変更した場合の効果を再現する画像のスタックです。画像のスタックが生成されると、焦点体積内の被写体の位置を得なければならない。このような局所強度分散または空間周波数コンテンツとして画像解析ヒューリスティックの数は、試料¹⁵中の異なる点で焦点の鮮明度を定量化するために提示されている。特定の画像メトリックが最大化​​（または最小化）されたときにそれぞれの場合において、オブジェクトが焦点にあると考えられる。

オブジェクトが「ピントが合って」で、特定の焦点面を識別しようと他の方式とは異なり、この作品における方法は、pを選び出す焦点面の広い範囲で延長することができる対象となる物体の内側にあるoints、。このアプローチは、被験体の広い範囲に適用可能であり、そのような棒状コロイド、細菌の鞭毛鎖または真核生物のような拡張され、弱散乱サンプル（位相物体）に特に適している。物体が焦点面を通過する際にこのような試料では、画像のコントラストが変化し、それが他にある場合、オブジェクトが焦点面と暗い中心の一方の側にある場合、デフォーカス画像は、光の中心を有する。彼らは焦点面に正確に位置したときの純粋な位相物体なしコントラストがほとんどを持っている。コントラスト反転のこの現象は、他の著者によって^16,17について議論^し 、異常¹⁸グイ相へ、最終的に起因しているされています。これは他の場所で、技術の限界が評価される場所ホログラフィーの文脈で、より厳格な立場に置かれています。位置の典型的な不確実性は、EACさ150nm（約1ピクセル）のオーダーであるH方向^19。グイ相が異常方法は、三次元で拡張されたオブジェクトの構造を決定するためのいくつかの明確に定義されたDIHM方式の一つであるが、それにもかかわらず、いくつかのオブジェクトが再構成する問題がある。 （カメラを指差し）を光軸に沿って直接うそのオブジェクトを正確に再構築することは困難である。オブジェクトの長さと位置の不確実性が大きくなる。この制限は、ホログラムを記録する画素の制限されたビット深度（カメラが記録することができる別個の階調数）に一部である。対象とする物体が焦点面に非常に近い場合に、別の問題の設定が行われます。この場合、対象物の実および仮想イメージは解釈が困難である複雑な光学場を生じさせる、近接して再構築さ​​れる。ここ二、やや少ないの重要な関心事は、得られた回折縞がこの粗い粒度のINFのイメージセンサの少ないを占有していることであるormationが悪く品質の再構築につながる。

実際には、単純な勾配フィルタは、照射方向に沿った強い強度の反転を検出するための三次元再構成されたボリュームに適用される。強度は、暗い、またはその逆に光から迅速に変化する領域は、次いで、散乱領域に関連付けられる。これらの個々の寄与の合計が簡単にレイリー·ゾンマーフェルトバックプロパゲーション法を用いて反転され、全散乱場を与えるために、弱散乱体がよく、そのような要素²⁰の非干渉コレクションとして記載されている。本論文では、軸方向の強度勾配技術は連鎖球菌細胞のチェーンに適用されます。細胞体は、位相物体である（種E.コリは ​​、波長λ= 589 nmで1.384であると^21を測定した屈折率を有し、 ストレプトコッカス株は類似している可能性がある）とに接続されたブロブの高輝度鎖として現れる目勾配フィルタ後の電子の試料体積が適用された。この濾過ボリュームに適用基準閾値と特徴抽出方法は、細胞内領域に対応する体積画素（ボクセル）の抽出を可能にする。この方法の特別な利点は、それが軸方向の物体の位置の明確な再構成を可能にすることである。同様の方法が（少なくとも、顕微鏡対物レンズを通して撮像対象に近いもの、そのレコードのホログラムは、）、この変位の符号を決定することができないことに苦しんでいます。レイリー·ゾンマーフェルト再構成法もあるが、署名に依存しないこの意味では、勾配の動作は、私たちは、焦点面の上下の弱位相物体を区別することができます。

Protocol

1。セットアップとデータ収集凍結ストック22から連鎖球菌菌株V4051-197 KTY培地（スムーズな水泳）細胞の培養物を育てる。飽和するまで、35℃、150rpmで一晩、回転式シェーカーでインキュベートする。 飽和文化500μlの新鮮なKTY培地10mlに接種。細胞はλ= 600nmで（約5×10 8個/ ml）で約1.0の光学密度に達するまで35℃、150rpmでさらに3.5時間インキュベートする。 …

Representative Results

DIHMの能力を実証するために、実験は、 ストレプトコッカス属細菌の鎖上で実施した。チェーン自体は長い10.5ミリメートルを測定し、範囲0.6〜1ミクロンの直径を有する6-7球面円柱細胞（チェーン内のセルの2が分裂に近い）から構成されていた。 図1aおよび1bのショーのメインインタフェースを復興とレンダリングソフトウェアの。数値的再集束手順の例は、?…

Discussion

この実験プロトコルの中で最も重要なステップは、安定した実験装置からの画像の正確なキャプチャです。貧しい背景データと、高忠実度の再構築は不可能に近い。これは、再構成された画像を劣化させることができるように、（対物レンズの背面から見て暗色年輪として可視）内部位相差素子と対物レンズを回避することも重要である。関心のあるオブジェクトは、回折縞のいくつかのペ?…

Materials

Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm
LED power supply	Thorlabs	LEDD1B
Thread Adapter	Thorlabs	SM2T2
Thread Adapter	Thorlabs	SM1A2
Frame Grabber board	EPIX	PIXCI E4
High-Speed CMOS camera	Mikrotron	MC-1362