القبض في وقت واحد في الوقت الحقيقي الصور في قناتين الانبعاثات باستخدام نظام تقسيم كاميرا مزدوجة الانبعاثات: تطبيقات لخلية التصاق
Summary
نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة للاللونين مضان المجهري توليد تسلسلات الصور في الوقت الحقيقي مع دقة بصرية والزماني استثنائية، وهو شرط لبعض المقايسات الخلية الحية بما في ذلك بالتوازي المقايسات غرفة تدفق وحة التصاق. عندما يعمل البرنامج لدمج الصور من القنوات الانبعاثات المكتسبة في وقت واحد، ويتم إنتاج تسلسلات الصور pseudocolored.
Abstract
متعددة الألوان المناعي المجهري للكشف عن جزيئات معينة في غشاء الخلية يمكن أن يقترن مع المقايسات غرفة تدفق موازية لوحة للتحقيق في الآليات التي تحكم التصاق الخلية في ظل ظروف تدفق الحيوية. على سبيل المثال، وسرطان الخلايا المسمى مع fluorophores متعددة يمكن perfused على ركيزة يحتمل رد الفعل لنمذجة آليات الانبثاث السرطان. ومع ذلك، متعدد القنوات أنظمة كاميرا واحدة ولون الكاميرات أوجه القصور المعرض في الحصول على الصور في الوقت الحقيقي للتحليل الخلية الحية. للتغلب على هذه القيود، استخدمنا كاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوجة في وقت واحد لالتقاط تسلسل الصور في الوقت الحقيقي من الخلايا fluorescently المسمى في غرفة التدفق. ويتراوح الطول الموجي مرشح أنظمة تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة محددة في اثنين من الكاميرات أحادية اللون اتفاقية مكافحة التصحر، وبالتالي التقاط صور متطابقة في وقت واحد اثنين مكانيا ولكن fluorophore محددة. بعد ذلك، يتم الجمع بين psuedocolored الصور قناة واحدة الى واحدفي الوقت الحقيقي اندمجت تسلسل التي يمكن أن تكشف عن العديد من الجزيئات المستهدفة على خلايا تتحرك بسرعة عبر منطقة الفائدة.
Introduction
طرق لتحليل جزيئات على سطح الخلية، مثل المناعية، وتوظيف تحقيقات التي مترافق كيميائيا لfluorophores، مما يسمح للكشف عن الجزيئات المستهدفة. وعادة ما يتم تسجيل التصوير الخلية الحية والهيدروديناميكية فحوصات التصاق الخلية المستندة إلى تدفق مع الكاميرات أحادية اللون CCD صمم للقبض على العمليات الفسيولوجية على المستوى الخلوي و / أو الجزيئية 1، 2. هذه الكاميرات هي حساسة للغاية، وتقديم معدلات الإطار بسرعة (أكبر من 30 لقطة في الثانية الواحدة)، وتقديم القرار الزماني استثنائية (بسبب معدلات الإطار بسرعة ومرات التعرض القصير). ومع ذلك، يمكن للكاميرات التقاط أحادية اللون فقط قناة واحدة الانبعاثات (الكشف عن fluorophore واحد) لجمع الصور. ويمكن إدراج نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا واحدة لالتقاط القنوات الانبعاثات متعددة ولكن غالبا ما يقلل من مجال الرؤية وتتطلب الوقت نفسه التعرض لتصوير جميع القنوات. لالتقاط ألوان الطيف الكامل من الخلايا المسمى مع multipلو fluorophores، وكاميرا اللون يمكن استخدامها كبديل. ومع ذلك، والكاميرات اللون ليست قادرة عموما على تقديم القرار الزماني المطلوب لتصوير الخلايا الحية في بعض التطبيقات. هناك حاجة إلى جهاز التصوير أخرى للتطبيقات الذي هو مفيد لصورة الخلايا الحية في موجات متعددة مع الحفاظ على القرار الزماني عالية. تطبيق تجريبي رئيس هو مواز لوحة غرفة تدفق التصاق الفحص، التي و perfused الخلايا في الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية على ركيزة يحتمل رد الفعل 1، 3. الخلايا في تدفق التي تعبر عن جزيئات محددة سطح الخلية قد تلتزم ولفة على الركيزة، مثل أحادي الطبقة الخلية التعبير عن جزيئات الالتصاق أو البروتينات المصفوفة خارج الخلية، كثف السطح 4، 5. الخلايا المتداول قد تخضع حركة دورانية ومتعدية في أجزاء من الثانية. الميزات الجزيئية على المتداول والخلايا الملتصقة، مثل مجموعات من جزيئات سطح الخلية، وأيضا potentiالقاعدة لإعادة تنظيم الخضوع نشطة على سطح الخلية. وبالتالي، يجب نظم التصوير يوفر القرار الزماني استثنائية (30 لقطة في الثانية أو أكثر و"قريبة من الصفر" مرات التعرض) لإنشاء تسلسل الصور التي توضح تطور خطوة بخطوة من الخلايا المتداول 6، 7. نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة قادرون على تلبية هذه المطالب لتصوير الخلايا المسمى مع fluorophores متعددة.
تقسيم نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة وقنوات مرشح مضان في اثنين من الكاميرات مماثلة لالتقاط الصور في وقت واحد اثنين متطابقة مكانيا ولكن fluorophore محددة مع الإبقاء على حقل كامل من الرأي. هذه التكنولوجيا تمكن المقارنة المباشرة من الصورة التي تم التقاطها في الوقت الحقيقي في كل قناة، وتتيح للمستخدم التبديل بسرعة بين نماذج الكاميرا مع قدرات التصوير المختلفة. هذه الميزة مفيدة لإجراء تعديلات على إعدادات التقاط الصور في كاميرا واحدة التي تسمح أفضل نظام لالتقاطfluorophores مع كثافات مختلفة، عمر، ومعاملات الانقراض 8. إلى جانب برامج التصوير، ونظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة تسمح للتسجيل في الوقت الحقيقي من فحوصات التصوير الخلية الحية في موجات متعددة، ويمكن أن تعزز في المختبر المقايسات التي تستخدم مضان لدراسة سلوك الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكاميرا الانبعاثات نظام تقسيم مزدوج لديه القرار المكانية والزمانية، والبصرية اللازمة لالتقاط صور ذات جودة عالية في التطبيقات حيث الخلية أو الحركة الجزيئية سريع. في توليد نتائج ممثل، تم الأمثل المعلمات في النظام المزدوج تقسيم الانبعاثات الكاميرا، بما في ذلك إعداد…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر الدكتور دوغلاس جويتز (قسم هندسة الكيميائية والبيولوجية، جامعة ولاية أوهايو) والدكتور فابيان Benencia (قسم العلوم الطبية الحيوية، جامعة ولاية أوهايو) لإجراء مناقشات الثاقبة ومراجعة مخطوطة. نشكر أيضا الدكتور كريستوفر Huppenbauer لإجراء مناقشات تقنية مفيدة (دبليو Nuhsbaum شركة). وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم (CBET-1106118)، والمعاهد الوطنية للصحة (1R15CA161830-01).
Materials
| Reagent/Material | |||
| BT-20 cells | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E cells | Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School) | ||
| MEM | Thermo Scientific | SH30024.01 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30396.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin / 0.1% EDTA | Thermo Scientific | SV30031.01 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555946 | |
| Anti-human CD24 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555426 | |
| Anti-rat IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2 Emission Splitter | Photometrics | DC2 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 software | Norpix |
References
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).
- Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).
- Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).
- Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
- Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).
- Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?. Front. Oncol. 2, 103 (2012).
- Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
- Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).
- Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).
- Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
- Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
- Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).
