Capture simultanément en temps réel des images en deux canaux d'émission en utilisant un système de fractionnement double caméra émission: Applications à l'adhésion cellulaire
Summary
Émissions des systèmes de séparation à double caméra pour deux couleurs microscopie à fluorescence générer en temps réel des séquences d'images avec une résolution optique et temporelle exceptionnelle, une exigence de certains tests cellulaires en direct, y compris des essais parallèles chambre d'écoulement de la plaque d'adhérence. Lorsque le logiciel est utilisé pour fusionner des images de canaux d'émission acquis simultanément, des séquences d'images pseudocolored sont produites.
Abstract
Multi-color microscopie par immunofluorescence pour détecter des molécules spécifiques dans la membrane cellulaire peut être couplé avec des dosages en parallèle de la chambre d'écoulement de la plaque pour étudier les mécanismes qui régissent l'adhérence cellulaire dans des conditions d'écoulement dynamique. Par exemple, les cellules cancéreuses marquées avec des fluorophores multiples peuvent être perfusées sur un substrat potentiellement réactifs pour modéliser les mécanismes de la métastase cancéreuse. Cependant, multi-canaux systèmes de caméras et appareils photo unique de couleur présentent des lacunes dans l'acquisition d'image pour analyse en temps réel des cellules vivantes. Pour surmonter ces limitations, nous avons utilisé un système de séparation des émissions de double caméra pour capturer simultanément en temps réel des séquences d'images de cellules marquées par fluorescence dans la chambre d'écoulement. Longueur d'onde filtre des systèmes de séparation d'émission de l'appareil photo à double sens varie en deux caméras CCD monochrome, capturant ainsi simultanément deux images identiques mais spatialement spécifique fluorophores. Par la suite, psuedocolored images d'un canal sont combinés en un seulen temps réel a fusionné la séquence qui peut révéler de multiples molécules cibles sur des cellules se déplaçant rapidement à travers une région d'intérêt.
Introduction
Des procédés pour l'analyse de molécules sur la surface des cellules, telles que l'immunocoloration, emploient des sondes qui sont chimiquement conjugués à des fluorophores, ce qui permet la détection de molécules cibles. Imagerie des cellules vivantes et hydrodynamiques des essais d'adhérence des cellules basées sur les flux sont généralement enregistrés avec des caméras CCD monochrome conçus pour capturer les processus physiologiques au niveau cellulaire et / ou moléculaire 1, 2. Ces caméras sont très sensibles, offrir des taux de trame rapides (plus de 30 images par seconde), et de fournir une résolution temporelle exceptionnelle (en raison de taux de trame rapides et des temps d'exposition court). Toutefois, les caméras monochromes ne peuvent capturer un canal d'émission unique (détection d'un seul fluorophore) pour recueillir des images. Simples systèmes caméra émission de séparation peuvent être incorporés à capturer plusieurs canaux d'émission mais réduisent souvent le champ de vision et nécessitent le même temps d'exposition pour l'imagerie de tous les canaux. Pour capturer le spectre complet des couleurs de cellules marquées par multiparele fluorophores, une caméra couleur peut être utilisé comme une alternative. Cependant, les caméras couleurs ne sont généralement pas capables de fournir la résolution temporelle souhaitée pour l'imagerie des cellules vivantes dans certaines applications. Un autre dispositif de formation d'image est nécessaire pour les applications dans lesquelles il est avantageux de l'image des cellules vivantes dans des longueurs d'ondes multiples tout en conservant une haute résolution temporelle. Une application expérimentale de choix est l'analyse de l'adhérence de la chambre d'écoulement à plaques parallèles, dans lequel les cellules sont perfusées dans des conditions physiologiquement pertinentes sur un substrat potentiellement réactif 1, 3. Les cellules dans le flux qui expriment des molécules de surface spécifiques de cellules peuvent adhérer et roulent sur le substrat, par exemple une monocouche de cellules exprimant des molécules d'adhésion ou des protéines de surface adsorbé extracellulaires matricielles 4, 5. Cellules de roulement peuvent subir un mouvement de rotation et de translation en une fraction de seconde. Les caractéristiques moléculaires et de laminage sur les cellules adhérentes, telles que des grappes de molécules de surface cellulaire, ont également le potentiomètreal à subir une réorganisation active sur la surface de la cellule. Ainsi, les systèmes d'imagerie doivent fournir une résolution temporelle exceptionnel (30 images par seconde ou plus, et "proche de zéro" temps d'exposition) pour générer une séquence d'images qui illustre la progression étape par étape de la cellule de roulement 6, 7. Systèmes de séparation double caméra d'émission sont capables de répondre à ces exigences pour l'imagerie de cellules marquées avec des fluorophores multiples.
Systèmes de séparation double caméra d'émission répartis et canaux de fluorescence de filtre en deux caméras semblables à capturer simultanément deux images identiques mais spatialement spécifique fluorophores tout en conservant la totalité du champ de vue. Cette technologie permet la comparaison directe de l'image capturée en temps réel dans chaque canal et permet à l'utilisateur de basculer rapidement entre les modèles d'appareil photo avec différentes capacités d'imagerie. Cette fonction est utile pour faire des ajustements aux paramètres de capture d'image dans un appareil photo qui mieux permettre au système de capturefluorophores avec différentes intensités, durées de vie, et des coefficients d'extinction 8. Couplée avec un logiciel d'imagerie, des systèmes de séparation d'émission de caméra double permet l'enregistrement en temps réel en direct des dosages d'imagerie des cellules dans les longueurs d'onde multiples et peuvent améliorer les essais in vitro qui utilisent la fluorescence pour étudier le comportement des cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système de fractionnement des émissions de double caméra a une résolution spatiale, temporelle, et optique nécessaire pour capturer des images de haute qualité dans des applications où la cellule ou le mouvement moléculaire est rapide. Dans la génération des résultats représentatifs, les paramètres du système de fractionnement caméra émission double, y compris les paramètres logiciels et réglages de l'appareil, ont été optimisés pour obtenir une séquence d'image fusionnée dans laquelle …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Douglas Goetz (Département de chimie et génie biomoléculaire de l'Université de l'Ohio) et le Dr Fabian Benencia (Département des sciences biomédicales, Université de l'Ohio) pour des discussions pertinentes et évaluation des manuscrits. Nous remercions également le Dr Christopher Huppenbauer pour les discussions techniques utiles (W. Nuhsbaum Inc.). Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (CBET-1106118) et les National Institutes of Health (1R15CA161830-01).
Materials
| Reagent/Material | |||
| BT-20 cells | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E cells | Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School) | ||
| MEM | Thermo Scientific | SH30024.01 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30396.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin / 0.1% EDTA | Thermo Scientific | SV30031.01 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555946 | |
| Anti-human CD24 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555426 | |
| Anti-rat IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2 Emission Splitter | Photometrics | DC2 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 software | Norpix |
References
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