导管内注射局部给药的小鼠乳腺

Summary

一种协议，用于非侵入性导管内输送水性试剂的小鼠乳腺进行说明。该方法利用局部注射到专门针对乳腺导管乳腺的乳头。这种技术可适于多种化合物，包括的siRNA，化疗剂和小分子。

Abstract

在此我们描述了一个协议，提供各种试剂通过导管注射小鼠乳腺。局部给药和敲低内的乳腺上皮细胞的基因已经难以实现由于缺乏适当的靶向分子，是独立的，如怀孕和哺乳期的发育阶段的。本文中，我们描述了用于试剂的局部递送到乳腺在通过导管注射到小鼠的乳头在成年期的任何阶段的技术。注射剂可以在活体小鼠中进行，在麻醉状态下，并允许非侵入性和局部药物输送到乳腺。此外，注射剂可以重复在几个月而不损坏乳头。重要的染料，如伊文思蓝是来学习的技术非常有帮助。经导管内注射蓝色染料，整个导管树变得肉眼可见的。此外，荧光标记试剂也允许在乳腺内的可视化和分布。这种技术可适于多种化合物，包括的siRNA，化疗剂，和小分子。

Introduction

小鼠乳腺是由一个复杂的导管肺泡树收敛到在乳头中央管。在小鼠以及人类中，大多数乳腺肿瘤起源于上皮细胞衬乳管。目前可用的治疗包括静脉化疗，放疗和手术治疗。局部导管的治疗已经探索^1-3，并提供在减少的毒性和副作用方面显著优点。然而，在这些可以更广泛地应用于一些挑战依然存在。在小鼠乳腺执行程序相媲美的能力，有利于导管内干预的表征。这里，我们提出的递送试剂的直接进入小鼠乳腺导管的非侵入性方法。

导管内输送的两种乳腺癌患者和小鼠模型的化疗剂已被证明是没有证据的高效全身毒性或长期的病理改变^3-6。此外，肿瘤细胞注射及癌基因的慢病毒载体传递已经显示出以前通过导管注射^7-10是可行的。

除了药物释放，这个过程是乳腺基因通过导管内注射的siRNA沉默本地有用。注射少量的siRNA的解决方案是在不改变乳腺的解剖学和生理学有效。在我们的实验室，我们最近表明在转基因小鼠的关键调解人的基因，自发发展造成预防肿瘤进展（Brock 等人 ，未发表）的乳腺肿瘤成功的沉默。我们已经能够以没有明显的组织损伤或毒性重复每两周注射到相同的乳头最多7次在2周的时间间隔。

导管内注射可在成年小鼠，以解决发育定时孕期，哺乳期和退化或肿瘤的发生和发展过程中的目标后期阶段有关乳腺发育opmentally特定的事件。处女女年仅8周龄时已注入非侵入性在我们的实验室。

Protocol

1。注射液的制备

1. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）或其他感兴趣的水溶液制备的0.2％Evans蓝染料。这一重要的染料是用于评估导管内注射的成功和有用的技术开发的专业知识时，建议作为可视化助剂。

所需要的量将取决于待注射的腺体的数量和位置。雌性小鼠的所有10个乳腺可以被注入，但由于较小的腺大小，腺对1和5通常注射10微升的溶液。所有其他的乳腺对注射用20μl。这些卷都足以填满整个导管树。

2。术前准备

1. 记录体重每只小鼠。如同所有的临床前研究，动物权重应定期监测（每周两次或以上），以评估潜在的毒性。
2. 麻醉米乌斯使用异氟醚室和敷眼部润滑剂。在实验过程中的小鼠会继续经由鼻锥使用异氟烷在氧气吸入2-4％的浓度进行麻醉。仔细监视鼠标的变化呼吸频率，相应地调节异氟醚的水平。
3. 美洛昔康注射（5-10毫克/千克）的程序为皮下镇痛前。
4. 申请过的非处方脱毛膏乳头区。等待5分钟，然后轻轻取出松散的头发使用圆周运动棉花尖端涂药。使用湿用温水湿纸巾除去霜。剃须不会由于损坏的乳头的风险推荐。
5. 轻轻向下录音四肢固定鼠标的立体镜之下。
6. 清洁注射部位用酒精棉签。

3。导管内注入

1. 找到合适的乳头立体镜下被注入。用细微解剖故作多情zers，以消除任何死皮覆盖乳头开口。
2. 负载10-20微升注射液加入到50微升注射器上贴上33 G，金属轮毂针。有时候，注射后，少量（1微升或更少）可以在拔出针头漏出的乳头。因此，建议注入11或21微升分别占潜在损失。
3. 轻轻握住乳头与细镊子和其轻轻抬起来定位它注射。这是没有必要削减乳头。
4. 注射液缓慢，尽量减少所造成的乳腺导管管腔内快速移动的流体的潜在损害。喷射率应保持在约40微升/分钟。

4。术后护理

1. 观察注射部位。应该有创伤的乳头区域或周围组织没有任何迹象。肿胀的乳头周围的区域可能表明一个乳腺脂肪垫注射过早地r除一个成功的导管内注入。
2. 从鼻锥取出的动物，并移动到恢复一个单独的笼子里。放置在热灯下笼，防止低温和协助恢复。小鼠单独圈养，并会密切监察，直到他们恢复意识和流动性。

5。乳腺组织分析

1. 经研究完成后，将小鼠颈椎脱臼在一个隔室下面的CO ₂的压缩气体安乐死。乳腺切下并可以用于整个装载制备^11，组织学，或者RNA ​​和蛋白质分离。

Representative Results

乳头可以使用立体显微镜一旦头发已经在其周围（ 图1A）的区域被去除容易地本地化。掌握注射技术，建议注射伊文思蓝染料和监测腺体的完整性（ 图1B和C）。这种方法也允许适当体积被注入到各压盖作为一个可以在视觉上评估该染料是否达到整个导管系统（ 图1C和图2A）的测定。注射Evans蓝的图像的图像然后可以相对于整体式乳腺，其中整个导管树沾有胭脂红明矾染料（ 图2B）。

请注意，该喷射方法的鲁棒性是高度依赖于操作者。例如，穿孔的导管将导致乳腺脂肪垫注射和注射该溶液过快，可能会损坏导管上皮大公ls和引发炎症反应。成功的导管内注射使局部药物输送到乳腺，并减少非特异性的副作用常常观察到，否则。

一个腺体的一例图象注射荧光标记的siRNA靶向亲环素（一种非必需基因）示于图3。

图1。通过与文思蓝染料乳头腹股沟乳腺注入。 A）注射液与20μl伊文思蓝染料后乳头注入和 B之前外观）。没有肿胀或组织损伤是观察。C）一旦打开皮肤，染料允许整个乳腺导管树的可视化。

图2。整个安装埃文斯蓝的分析遭离弃的腺体。 A）一种解剖腺从动物切除和脂肪后的同一腺与胭脂红染料注射B）整装染色后立即铺展在载玻片上的代表性图像已被清除。以A）的比较证实了注射液填补了乳腺导管树和腺体在解剖学上是完整的。

图3。新鲜的组织样本导管内交付荧光的siRNA。代表形象，切除48小时postinjection。

Discussion

转基因和基因敲除小鼠是研究各个基因在乳腺癌体内的作用非常宝贵的工具。然而，这是昂贵和费时的，以产生这些动物和基因敲除通常是无处不在的，有时会令我们无法认识到基因对乳腺的具体效果。因此，靶向敲低会减轻在其他器官中的非特异性的副作用和毒性问题。

导管内注射的siRNA这里提出使在小鼠乳腺的局部基因敲除。它是一个快速的方法靶向和局部药物递送到乳腺不限于siRNA递送。这样的乳腺特异性药物递送避免了非特异性的副作用和毒性的其他器官，并允许基因变异的研究在乳腺发育和乳腺肿瘤的形成过程中的特定时间点。没有证据显示硅核糖核酸颗粒在非注射腺，肝脏或其他器官提供了进一步的证据表明，这种方法提出了在乳腺局部的基因敲除的优选方式。此外，胰管内注入可以每周或每两周重复在几个月内以允许长期监测的治疗剂。

这种技术开辟了可能性用于测定的导管内输送各种试剂对小鼠乳腺导管。在充分表征的小鼠模型中局部递送进展加快的非侵入性的应用中，有针对性的在人类中的治疗策略。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane			2-4%
meloxicam			5-10 mg/ml
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129-10G	0.2% in PBS
hair removing cream	Veet		Choose sensitive option
stereoscope	Zeiss	Stemi DV4
micro-dissecting tweezers	Roboz	rs-4976	With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar
Hamilton syringe	Hamilton	7637-01
33-gauge needle	Hamilton	7803-05	point style 4, 12 degree bevel (standard)
siGLO cyclophilin B control siRNA	Dharmacon	D-001610-01-05