Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d'étudier l'intégration synaptique
Summary
Dans cet article, nous introduisons rapide micro-iontophorèse de neurotransmetteurs comme une technique pour étudier l'intégration des signaux post-synaptiques avec une grande précision spatiale et temporelle.
Abstract
L'un des intérêts fondamentaux en neurosciences est de comprendre l'intégration d'entrées excitateurs et inhibiteurs long de la structure très complexe de l'arbre dendritique, ce qui conduit finalement à la sortie neuronale de potentiels d'action à l'axone. L'influence de divers paramètres spatiaux et temporels de l'entrée synaptique spécifique sur la production neuronale est actuellement à l'étude, par exemple, l'atténuation dépendante de la distance d'entrées dendritiques, l'interaction dépendant de la localisation des entrées spatialement distincts, l'influence de l'inhibition GABAergig sur l'intégration d'excitation, linéaire et modes d'intégration non-linéaires, et beaucoup plus.
Avec rapide micro-iontophorèse de glutamate et le GABA, il est possible d'étudier précisément l'intégration spatiale et temporelle de l'excitation et l'inhibition GABAergique glutamatergique. Exigences techniques critiques sont soit une lampe fluorescente déclenché, la diode électroluminescente (LED), ou une à deux photons scanning microscope pour visualiser branches dendritiques sans introduire significative photo-dommages des tissus. En outre, il est très important d'avoir un amplificateur micro-iontophorèse qui permet de compensation de capacité rapide de pipettes à haute résistance. Un autre point crucial est que aucun émetteur est involontairement libéré par la pipette pendant l'expérience.
Une fois établie, cette technique va donner des signaux fiables et reproductibles avec une grande neurotransmetteur et l'emplacement spécificité. Par rapport au glutamate et le GABA uncaging, ionophorèse rapide permet d'utiliser deux émetteurs en même temps, mais à des endroits très éloignés sans limitation dans le champ de vue. Il ya aussi des avantages par rapport à une stimulation électrique des axones focale: avec micro-iontophorèse l'emplacement du site d'entrée est définitivement connus et il est sûr que seul le neurotransmetteur d'intérêt est publié. Cependant, il doit être considéré que la micro-iontophorèse seulement l'postsynapse est activé et aspects présynaptique de la libération de neurotransmetteurs ne sont pas résolus. Dans cet article, nous montrons comment mettre en place des micro-iontophorèse dans des expériences de tranches de cerveau.
Introduction
Neurones dans le système nerveux central reçoivent une variété d'entrées synaptiques sur leurs processus dendritiques fines et ramifiées 1. Là-bas, la majorité des entrées dendritiques excitateurs sont médiés par des synapses glutamatergiques. Ces synapses peuvent être activés de façon répartie dans l'espace, ce qui entraîne l'intégration linéaire post-synaptique des potentiels post-synaptiques excitateurs (EPSP). Si les synapses sont activées simultanément et à proximité spatiale sur la dendrites, ces entrées excitatrices peuvent être intégrés supra-linéaire et génèrent des pointes dendritique 2-5.
De plus, l'intégration des entrées excitatrices dépend de l'emplacement de l'entrée sur l'arbre dendritique. Signaux qui arrivent à la région de la touffe distale sont beaucoup plus atténué que les intrants proximales en raison de câble filtrage 6. Dans l'hippocampe, des entrées vers les dendrites éloignés de touffes apicales sont générés par une région du cerveau différentes de celles sur dendri proximaleTES 7. Une question intéressante est donc de savoir comment entrée synaptique est traitée par différents compartiments dendritiques et si l'intégration dendritique réglemente l'influence de ces entrées en couches sur la décharge neuronale de différentes manières.
Non seulement les propriétés fonctionnelles, les caractéristiques morphologiques de la Dendrite, le lieu et le regroupement des entrées affectent l'intégration dendritique d'entrées excitateurs, aussi les entrées inhibitrices supplémentaires à partir de terminaux GABAergiques un facteur déterminant pour l'efficacité des synapses glutamatergiques 8,9. Ces différents aspects de l'intégration synaptique peuvent être idéalement étudiés en utilisant neurotransmetteur micro-iontophorèse, ce qui permet une application définie dans l'espace des différents neurotransmetteurs à des domaines dendritiques. Nous montrons ici comment mettre en place avec succès des micro-iontophorèse de glutamate et de GABA pour enquêter sur l'intégration du signal dans les neurones.
Pour cette application, à pointe finepipettes à haute résistance remplis de solutions de neurotransmetteurs concentrés sont utilisés. Ces pipettes sont positionnés à proximité de la membrane externe de la cellule, où les récepteurs de neurotransmetteurs sont situés. Une bonne visualisation des branches dendritiques est nécessaire. Le mieux est réalisé en utilisant des colorants fluorescents qui sont introduits via la pipette de patch. Ensuite, une très courte (<1 ms) d'impulsions de courant (dans la plage de 10 à 100 nA) est utilisé pour éjecter les molécules de neurotransmetteurs chargées. Avec ces courtes impulsions et de la rémunération de la capacité effective, potentiels ou courants post-synaptiques peuvent être évoqués avec précision temporelle et spatiale, ce qui signifie que l'emplacement de l'entrée excitatrice est connue avec précision. Glutamate micro-iontophorèse peut activer synapses dans un rayon défini, ce qui est inférieur à 6 um comme indiqué ici (Figure 1 9), mais il est également possible de parvenir à la résolution de la synapse unique 10-12.
Heine, M., et al </em> a montré que la résolution spatiale rapide micro-iontophorèse peut même être ajusté à repérer tailles inférieures à 0,5 um, ce qui est plus petite que la taille des spots régulièrement obtenus avec uncaging deux photons de glutamate 13. Avec rapide micro-iontophorèse, il est facilement possible d'utiliser deux ou plusieurs pipettes iontophorétiques et les placer à des endroits différents, même éloignés sur l'arbre dendritique. De cette manière, l'intégration des événements excitants, y compris ceux provenant de différentes voies, peut être étudiée. Il est également possible d'utiliser un glutamate et une pipette remplie par iontophorèse GABA dans le même temps. De cette façon, l'effet de l'inhibition GABAergique à différents emplacements par rapport à l'entrée d'excitation (en chemin, hors sentier inhibition) peut être étudiée. En outre, l'impact de l'inhibition par les interneurones ciblant les domaines neuronales spécifiques, comme dendrites distales, soma ou axones 14, peut être étudiée en utilisant l'iontophorèse GABA. Dans les neurones en culture, rapide micro-iontophorèse offre la possibilité d'investigate distribution de synapse unique et les aspects élémentaires de la communication synaptique dans les neurones dans beaucoup plus de détails 10,11.
Dans cet article, nous montrons en détail comment établir iontophorèse glutamate et de GABA pour l'utilisation dans des tranches de cerveau aigus, ce qui permet d'instruction intégration synaptique des entrées excitateurs et inhibiteurs en fonction de l'emplacement d'entrée, les forces d'entrée, et le moment, seul ou en interaction. Nous allons souligner les avantages et les limites de cette technique et comment résoudre avec succès.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous expliquons ici comment appliquer rapidement des micro-iontophorèse de neurotransmetteurs pour enquêter sur l'intégration synaptique sur dendrites. Cette technique a été utilisée avec succès pour étudier la transmission synaptique glutamatergique et GABAergique dans différentes régions du cerveau in vitro et in vivo 9,20-22. Micro-iontophorèse a été utilisé pendant plus de 60 ans, mais dans les premières années, il a été principalement utilisé pour appliquer localement neur…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann et Walker Jackson pour la lecture attentive du manuscrit. Les auteurs ont reçu des fonds qui ont été fournis par le ministère de la recherche MIWF de l'état Rhénanie du Nord-Westphalie (SR), le BMBF-Projekträger DLR collaboration américano-allemand en neurosciences computationnelles (CRCNS; SR), des centres d'excellence dans les maladies neurodégénératives (COEN; SR), et l'Université du programme de financement intra-muros Bonn (BONFOR; SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neurosciences. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neurosciences. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
