Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic
Summary
Neste artigo, apresentamos rápido micro-iontoforese de neurotransmissores como uma técnica para investigar a integração de sinais de pós-sinápticos com alta precisão espacial e temporal.
Abstract
Um dos interesses fundamentais da neurociência é compreender a integração dos insumos excitatórios e inibitórios ao longo da estrutura muito complexa da árvore dendrítica, que eventualmente leva à produção neuronal de potenciais de ação no axônio. A influência de diversos parâmetros espaciais e temporais da entrada sináptica específica na saída neuronal está atualmente sob investigação, por exemplo, a atenuação dependente da distância das entradas dendríticas, a interação local-dependente de insumos espacialmente segregadas, a influência da inibição GABAergig na integração excitatório, linear e modos de integração não-lineares, e muitos mais.
Com o rápido micro-iontoforese de glutamato e GABA é possível investigar precisamente a integração temporal e espacial da excitação glutamatérgica e inibição GABAérgica. Requisitos técnicos críticos são ou uma lâmpada fluorescente triggered, diodo emissor de luz (LED), ou dois fótons scanning microscópio para visualizar ramificações dendríticas sem introduzir significativa da foto-dano do tecido. Além disso, é muito importante ter um amplificador de micro-iontoforese que permite a compensação de capacitância rápido de pipetas de alta resistência. Outro ponto crucial é que nenhum transmissor é involuntariamente divulgado pela pipeta durante o experimento.
Uma vez estabelecida, esta técnica vai fazer sinais fiáveis e reproduzíveis com um elevado neurotransmissor e especificidade de localização. Comparado ao glutamato e GABA uncaging, iontoforese rápida permite a utilização de ambos os transmissores, ao mesmo tempo mas em locais distantes, sem limitação para o campo de visão. Há também vantagens em comparação à estimulação elétrica focal de axônios: com micro-iontoforese a localização do local de entrada é definitivamente conhecido e é certo que só o neurotransmissor de interesse é liberada. No entanto, tem de ser considerado que, com micro-iontoforese apenas opostsynapse é ativado e os aspectos pré-sinápticos de liberação de neurotransmissores não são resolvidos. Neste artigo, vamos demonstrar como configurar o micro-iontoforese em experimentos fatia do cérebro.
Introduction
Os neurónios no sistema nervoso central receber uma variedade de entradas sinápticas em seus processos dendríticos finas e ramificadas 1. Ali, a maioria das entradas dendríticas excitatórios são mediadas por sinapses glutamatérgicas. Estes sinapses pode ser activado de um modo espacialmente distribuídos, resultando na integração linear pós-sináptico excitatório de potenciais pós-sinápticos (EPSPS). Se as sinapses são activados simultaneamente e em proximidade espacial do dendrito, estas entradas excitatórias podem ser integrados supra-linearmente e gerar picos dendrítica 2-5.
Além disso, a integração das entradas excitatórios depende da localização da entrada na árvore dendrítica. Os sinais que chegam à região tufo distal são muito mais atenuada do que entradas proximais, devido ao cabo de filtragem 6. No hipocampo, entradas distantes para os dendritos apicais de tufos são geradas por uma região do cérebro diferentes do que aqueles em proximal dendrites 7. Uma pergunta interessante é, portanto, como a entrada sináptica é processado por diferentes compartimentos dendríticas e se a integração dendrítica regula a influência desses insumos em camadas sobre a ativação neuronal em diferentes maneiras.
Não só as propriedades funcionais, as características morfológicas da dendrite, a localização ea aglomeração das entradas estão a afectar a integração dendrítica de entradas excitatórios, também as entradas inibidores adicionais de terminais GABAérgicos crucial determinar a eficácia das sinapses glutamatérgicas 8,9. Estes diferentes aspectos da integração sináptica pode ser idealmente investigada utilizando neurotransmissor micro-iontoforese, o que permite a aplicação espacialmente definido de diferentes neurotransmissores para domínios dendríticas. Nós demonstramos aqui como estabelecer com sucesso micro-iontoforese de glutamato e GABA para investigar integração de sinal em neurónios.
Para esta aplicação, de ponta finapipetas cheias de alta resistência, com soluções concentradas de neurotransmissores são utilizados. Estas pipetas estão posicionadas perto da membrana exterior da célula, onde os receptores de neurotransmissores estão localizados. É necessária uma boa visualização das ramificações dendríticas. Este é melhor conseguido usando corantes fluorescentes, que são introduzidos através da pipeta patch. Em seguida, um muito curto (<1 ms) impulso de corrente (no intervalo de 10 – 100 nA) é usado para ejectar as moléculas carregadas neurotransmissores. Com estes pulsos curtos e compensação da capacitância efectiva, potenciais pós-sinápticos ou as correntes podem ser evocados com alta precisão espacial e temporal, o que significa que a localização da entrada excitatória é precisamente conhecida. O glutamato de micro-iontoforese pode activar sinapses em um raio definido, que é menor do que 6 um, como mostrado (Figura 1 9), mas também é possível chegar a resolução sinapse único 10-12.
Heine, M., et ai </em> mostraram que a resolução espacial dos micro-iontoforese rápido pode mesmo ser ajustado para detectar tamanhos abaixo de 0,5 um, o que é mais pequeno do que o local tamanhos obtidos regularmente com uncaging dois fotões do glutamato 13. Com micro-iontoforese rápido é facilmente possível usar dois ou mais pipetas iontoforéticos e colocá-los em locais diferentes, mesmo distantes na árvore dendrítica. Deste modo, a integração de eventos excitatórios, incluindo aqueles a partir de diferentes vias, pode ser investigada. Também é possível utilizar um glutamato e uma pipeta cheia iontoforético GABA ao mesmo tempo. Deste modo, o efeito da inibição GABAérgica em locais diferentes em relação à entrada de excitação (no caminho, a inibição fora do caminho) pode ser estudada. Além disso, o impacto da inibição por interneurónios objectivo domínios neuronais específicos, como os dendritos distais, soma ou axónios 14, pode ser investigado utilizando iontoforese GABA. Em neurônios cultivados, micro-iontoforese rápida oferece a oportunidade de investigate distribuição sinapse único e os aspectos elementares da comunicação sináptica em neurônios em muito mais detalhe 10,11.
Neste artigo, demonstram em pormenor a forma de estabelecer iontoforese glutamato e GABA para uso em fatias cerebrais agudas, que permite a investigação de integração sináptica de entradas excitatórios e inibitórios na dependência da localização de entrada, as forças de entrada e de temporização, sozinho ou em interacção. Vamos apontar as vantagens e limitações dessa técnica e como solucionar problemas com sucesso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui vamos explicar como aplicar rápida micro-iontoforese de neurotransmissores para investigar a integração sináptica em dendritos. Esta técnica tem sido utilizada com êxito para estudar a transmissão sináptica glutamatérgica e GABAérgicos em diferentes regiões do cérebro, in vitro e in vivo, 9,20-22. Micro-iontoforese tem sido usada há mais de 60 anos, mas nos primeiros anos era usado principalmente para se candidatar localmente neurotransmissores e drogas em escalas de tempo …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann e Walker Jackson para a leitura atenta do manuscrito. Os autores receberam financiamento que foi fornecido pelo Ministério da pesquisa MIWF do estado Renânia do Norte-Westfalia (SR), o BMBF-Projekträger DLR colaboração EUA-alemão em neurociência computacional (CRCNS; SR), Centros de Excelência em Doenças Neurodegenerativas (COEN; SR), e da Universidade de Bonn programa de financiamento intramural (BONFOR; SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neurosciences. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neurosciences. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
