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Biologie

Dithranol come Matrix Assisted Laser per Matrix desorbimento / ionizzazione Imaging su una trasformata di Fourier Ionorisonanza Ciclotronica Mass Spectrometer

Published: November 26, 2013
doi:
10.3791/50733
, ,
1University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre,University of Victoria, 2Department of Biochemistry and Microbiology,University of Victoria

Summary

Dithranol (DT; 1,8-diidrossi-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) è stato precedentemente segnalato come una matrice MALDI per l'imaging tessuto di piccole molecole; protocolli per l'uso di DT per l'imaging MALDI di lipidi endogeni sul superficie di sezioni di tessuto di positivo-ion MALDI-MS su uno strumento quadrupolo-FTICR altissima risoluzione sono forniti qui.

Abstract

Spettrometria di massa di imaging (MSI) determina la localizzazione e distribuzione pattern spaziali di composti sulla superficie di una sezione di tessuto, principalmente utilizzando MALDI (matrice desorbimento laser assistita / ionizzazione) basati tecniche analitiche. Sono necessarie nuove matrici per piccola molecola MSI, che possono migliorare l'analisi di basso peso molecolare (MW) composti,. Queste matrici dovrebbero fornire maggiori segnali di analiti riducendo segnali di fondo MALDI. Inoltre, l'uso di strumenti ad altissima risoluzione, come trasformata di Fourier ciclotrone ionico (FTICR) spettrometri di massa, ha la capacità di risolvere segnali analita da segnali a matrice, e questo può parzialmente superare molti problemi associati con lo sfondo proveniente dalla MALDI matrice. La riduzione delle intensità dei cluster matrice metastabili di FTICR MS può anche contribuire a superare alcuni dei disturbi associati con picchi matrice su altri strumenti. Ad alta risoluzionestrumenti quali gli spettrometri di massa FTICR sono vantaggiosi in quanto possono produrre modelli di distribuzione di molti composti contemporaneamente pur fornendo fiducia in identificazioni chimici. Dithranol (DT; 1,8-diidrossi-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) è stato precedentemente segnalato come una matrice MALDI per imaging dei tessuti. In questo lavoro, un protocollo per l'uso di DT per MALDI imaging lipidi endogeni dalle superfici di sezioni di tessuto di mammifero, da positivo ioni MALDI-MS, su un ibrido quadrupolo altissima risoluzione sono stati inseriti strumento FTICR.

Introduction

Spettrometria di massa di imaging (MSI) è una tecnica analitica per la determinazione della localizzazione e distribuzione pattern spaziali di composti sulla superficie di una sezione di tessuto 1,2. Matrix desorbimento laser assistita / ionizzazione (MALDI) MSI per l'analisi di peptidi e proteine ​​è stato usato per più di un decennio e ci sono stati grandi miglioramenti nei metodi di preparazione del campione, sensibilità di rilevamento, risoluzione spaziale, riproducibilità ed elaborazione dati 3,4. Combinando le informazioni risultanti dalle sezioni istologicamente colorate ed esperimenti MSI, patologi sono in grado di correlare le distribuzioni di composti specifici con le caratteristiche fisiopatologicamente interessanti 5.

I modelli di distribuzione di piccole molecole, tra cui farmaci esogeni 6,7 e loro metaboliti 8-10 sono stati interrogati tramite MALDI-MS tissutale 11. I lipidi sono forse il cla più ampiamente studiatass di composti con immagini MALDI, sia nelle SM 12-17 e MS / MS 18 modalità. L'uso di MALDI MSI per l'imaging piccola molecola è stata limitata da diversi fattori: 1) matrici MALDI sono essi stessi piccole molecole (tipicamente m / z <500), che generano segnali di ioni abbondanti. Questi segnali abbondanti possono sopprimere la ionizzazione di analiti piccole molecole e interferire con la loro rilevazione 19,20. Rivestimento senza solventi matrice 21, matrice sublimazione 22, e la matrice preverniciato MALDI MS 23, tra gli altri, sono stati sviluppati per migliorare l'MSI di piccole molecole.

Le nuove matrici che possono migliorare l'analisi di composti a basso MW sono di grande interesse per la piccola molecola MSI. Queste matrici dovrebbero fornire maggiori segnali di analiti con i segnali a matrice diminuito. Nella modalità positiva di litio, 2,5-diidrossibenzoico acido (DHB) e α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA) sono le due matrici MALDI MS comunemente utilizzati per MSI 24 </sup>. La matrice ideale sarebbe formare piccoli cristalli, in modo da preservare la localizzazione spaziale degli analiti. DHB tende a formare cristalli più grandi, quindi applicando la matrice mediante sublimazione è stata sviluppata per superare parzialmente questo problema, e ha permesso l'uso di questa matrice per l'imaging sensibile dei fosfolipidi 22,25. 9-Aminoacridine è stato usato per MSI di analiti protici in modalità positiva di litio e 26 nucleotidi e fosfolipidi nella modalità 26-29 di ioni negativi. 2-mercaptobenzotiazolo è stato trovato che invia rilevamento MALDI efficiente di lipidi 30, ed è stato utilizzato per l'imaging di cervello di topo gangliosidi 31. La risoluzione ultra della trasformata di Fourier ioni ciclotrone risonanza (FTICR) spettrometri di massa possono in qualche modo alleviare questo problema, risolvendo i segnali di analiti dai segnali matrice 32. Un altro vantaggio dell'uso di FTICR-MS è che le intensità dei cluster matrice metastabili sono riduzioneed 33, che riduce anche queste interferenze 27.

L'uso di ditranolo (DT; 1,8-diidrossi-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) come matrice MALDI per imaging dei tessuti è stato precedentemente riportato 34. In questo lavoro attuale, un protocollo dettagliato è fornito per l'uso del DT per il MSI di lipidi endogeni sulle superfici delle sezioni di tessuto lente bovina, in modalità positiva di litio.

Protocol

1. Tissue Sezioni Flash-congelare i campioni di emissione, una volta raccolte, utilizzando azoto liquido, li spediremo in ghiaccio secco (se richiesto spedizione), e conservarli a -80 ° C fino al sezionamento dei tessuti. (Se si usano campioni commerciali, garantiscono che i campioni sono preparati in questo modo.) Tagliare gli organi a una dimensione gestibile per adattarsi al bersaglio MALDI. Tagliare le parti indesiderate dell'organo. Per questo studio qui descritto, lenti di vitello erano d…

Representative Results

I campioni di tessuto che sono sezionate e montate disgelo sui vetrini ITO rivestite devono essere intatti, senza strappi visibile. Per molti tessuti, montaggio su un vetrino ITO rivestito disgelo tessuto diretta è accettabile. Per alcuni tessuti specifici come obiettivo bovini, ampia lacerazione del tessuto è spesso visto durante il montaggio disgelo diretta viene utilizzato (Figura 1a). Prerivestimento del vetrino ITO con etanolo o acido formico (Figura 1b) aiuta a mantenere l…

Discussion

Le considerazioni più importanti per il successo MALDI MSI sono: 1) la preparazione dei tessuti; 2) scelta della matrice; 3) l'applicazione della matrice e 4) l'interpretazione dei dati e l'analisi. Quando il campione e la matrice sono opportunamente preparate, l'acquisizione dati MS è automatizzato. L'analisi dei dati da questo tipo di esperimento è piuttosto costosa.

Preparazione dei tessuti adeguato è fondamentale per il successo delle sperimentazioni MALDI MSI. La…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero riconoscere Genome Canada e Genome British Columbia per il finanziamento della piattaforma e supporto. Ringraziamo anche il Dott. Carol E. Parker per la revisione critica del manoscritto assistenza e la modifica. CHL grazie anche British Columbia Proteomica di rete per il supporto.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Rat Liver Pel-Freez Biologicals 56023-2
Bovine Calf Lens Pel-Freez Biologicals 57114-2 Sample should be decapsulated29 before use
Dithranol (DT) Sigma-Aldrich 10608 MALDI Matrix
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA) Sigma-Aldrich 70990 MALDI Matrix
2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB) Sigma-Aldrich 85707 MALDI Matrix
Reserpine Sigma-Aldrich 83580
Terfenadine Sigma-Aldrich T9652
Formic Acid Sigma-Aldrich 14265
Ammonium Formate Sigma-Aldrich 14266
Ammonium Hydroxide Sigma-Aldrich 320145
Trifluoroacetic Acid (TFA) Sigma-Aldrich 302031
Water Sigma-Aldrich 39253
Methanol Sigma-Aldrich 34860
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967
Ethyl Acetate Sigma-Aldrich 34972
Isopropanol Sigma-Aldrich 34965
Chloroform Sigma-Aldrich 366927
Acetone Sigma-Aldrich 34850
Ethanol Commercial Alcohols 95%
ES Tuning Mix Agilent Technologies G2431A
ITO Coated Glass Slides Hudson Surface Technology PSI1207000 Ensure that samples are placed on the electrically conductive side
Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen Bic WOSQP11
Airbrush Sprayer Iwata Eclipse HP-CS
ImagePrep Bruker 249500-LS
MALDI adapter Bruker 235380
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References

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MALDI ImagingDithranol MatrixFTICR Mass SpectrometryLow-molecular Weight CompoundsEndogenous Lipids
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Citer Cet Article
Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H. Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer. J. Vis. Exp. (81), e50733, doi:10.3791/50733 (2013).
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