في المختبر الفحص لتقييم أثر مناعة مقررات تمهيدية بشأن فيروس نقص المناعة CD4 T محددة المستجيب خلية وظيفة
Summary
وضعنا مقايسة في المختبر للتحقيق في دور مسارات مناعة في تنظيم إفراز السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة.
Abstract
T خلية الإرهاق هو عامل رئيسي في إزالة الممرض فشلت خلال العدوى الفيروسية المزمنة. وupregulated مسارات مناعة، مثل PD-1 و IL-10، على هذا المستضد التعرض المستمر وتساهم في فقدان الانتشار، وانخفاض وظيفة لحل الخلايا، وضعف إنتاج السيتوكينات من قبل خلايا CD4 و CD8 T. في نموذج الفئران من الإصابة LCMV، إدارة منع الأجسام المضادة ضد هذه الممرات اثنين زيادة استجابات الخلايا التائية. ومع ذلك، لا يوجد حاليا أي فحص في المختبر لقياس أثر هذه الحصار على إفراز السيتوكينات في الخلايا من عينات الإنسان. لدينا بروتوكول والمنهج التجريبي تمكننا من تحديد بدقة وكفاءة إعادة إنتاج السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة من الموضوعات فيروس نقص المناعة البشرية المصابة.
هنا، ونحن تصور وتصميم التجارب في المختبر تمكن من قياسات إفراز السيتوكينات من الخلايا CD4 T فيروس نقص المناعة البشرية محددة وتأثيرها على سل أخرىمجموعات فرعية ل. تم استنفاد خلايا CD8 T من الدم الكامل وتم عزل PBMCs المتبقية عبر Ficoll طريقة الانفصال. ثم تم تحضين PBMCs المنضب CD8 مع منع الأجسام المضادة ضد PD-L1 و / أو IL-10Rα، وبعد التحفيز مع حمام سباحة الكمامة الببتيد HIV-1، وحضنت الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. بعد أن جمعت 48 ساعة، طاف للتحليل خلوى بواسطة صفائف الخرز وكريات خلية تم جمعها للتحليل المظهري إما باستخدام التدفق الخلوي أو تحليل النسخي باستخدام QRT-PCR. لتحليل أكثر تفصيلا، تم الحصول على السكان مختلفة من الخلايا عن طريق استنزاف فرعية انتقائية من PBMCs أو عن طريق الفرز باستخدام التدفق الخلوي قبل أن يتم تقييمها في نفس المقايسات. توفر هذه الأساليب نهج حساسة للغاية ومحددة لتحديد التشكيل الإنتاج خلوى من قبل خلايا تي المساعد مستضد محددة وتحديد التفاعلات الوظيفية بين مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية.
Introduction
خلال العدوى الفيروسية المستمرة، وخلايا محددة-T فيروس اكتساب عيوب وظيفية في عملية تعرف باسم الخلايا التائية الإرهاق. في الدراسات المجراة في نموذج الفئران من LCMV عدوى فيروسية مزمنة في وقت مبكر إلى أن الخلايا T الفيروس محددة استنفدت خفضت وظيفة لحل الخلايا ضد الخلايا المصابة فيروسي، وتفقد قدرتها على التكاثر وخفضت القدرة على إنتاج السيتوكينات مثل IL-2، TNF- α الإنترفيرون γ و1،2. شبكة معقدة من الممرات مناعة، مثل PD-1 و IL-10، وupregulated خلال الالتهابات المزمنة وتسهم في ضعف الخلايا التائية (إعادة النظر في 3،4). في الجسم الحي إدارة منع الأجسام المضادة ضد هذه الممرات المثبطة في الماوس LCMV نموذج استعادة وظيفة خلايا تي فيروس محددة استنفدت وتعزيز إزالة الفيروسية، مشيرا إلى أن استنفاد الخلايا التائية هي ظاهرة عكسها جزئيا (مراجعة في 5).
النتائج على التم تمديد ه نموذج LCMV بسرعة للعدوى الفيروسية المزمنة مثل الإنسان HBV، HCV وفيروس نقص المناعة البشرية 5. في المزمنة عدوى HIV-1، وupregulated PD-1 و IL-10 مسارات في مواضيع المصابة وترتبط مع معلمات من تطور المرض، مباشرة مع الحمل الفيروسي وعكسيا مع عدد CD4 6-8. الحصار الضد من PD-1 أو IL-10 مسارات في المختبر استعادة انتشار خلايا CD4 و CD8 T فيروس نقص المناعة البشرية محددة تشير إلى أن، على غرار نموذج LCMV الماوس، T استنفاد الخلايا لدى البشر هي ظاهرة عكسها جزئيا. ولكن نظرا إلى الطبيعة دقيق من التجارب على العينات البشرية فضلا عن القيود في حساسية في المختبر فحوصات، تحقيق شامل في الأوضاع استعادة الفنية من خلال هذه التدخلات حققت غائب لافت للنظر. وكانت فحوصات الانتشار، حتى الآن، والوحيدة التي يعول عليها في المختبر اختبار في معظم الدراسات الفحص، ولكن هناك نقصا ملحوظا من الأدلة على أثر هذه أمورالتدخالت على: 1) قدرة قتل الخلايا التائية السامة، 2) تأثير مضاد للفيروسات من خلايا T على تكاثر الفيروس، 3) الشخصى إفراز السيتوكينات، و 4) تأثير على CD4 الخلايا التائية المساعدة على مجموعات فرعية الخلايا الأخرى.
الخلايا تلطيخ خلوى (ICS) هو مفيد جدا وتستخدم على نطاق واسع على أساس مقايسة تدفق الخلوي الذي يستخدم للكشف عن إنتاج السيتوكينات في مختلف أنواع الخلايا في كل من الفئران والبشر. كما تم استخدامه لدراسة تأثير الحصار الضد من المسارات المثبطة. في المقايسات ICS، يتم حظر إفراز خلوى من خلال إضافة Brefeldin و / أو مونينسين. السيتوكينات المحاصرين داخل الخلايا ثم يتم الكشف عن الأجسام المضادة مع الفلورسنت باستخدام متعدد الألوان التدفق الخلوي. مدة الفحص عادة يقتصر على 6 أو 12 ساعة بعد التحفيز مستضد لأن كلا Brefeldin ومونينسين، والتي عادة المضافة داخل 2 ساعة من إضافة مستضد، هي سامة للخلايا. مقايسة ICS هي تقنية قوية التي كانت ط مفيدةن التحقيق من تأثير في الجسم الحي إدارة منع التدخل الأجسام المضادة في الفئران حيث تم استخراج الخلايا بعد فترة معينة من الوقت بعد التعرض الضد 9. ومع ذلك، هناك العديد من القيود لتطبيق هذا النهج التجريبية لتقييم أثر الحصار المفروض على المستقبلات المثبطة في العينات البشرية. عند تنفيذ التدخلات الضد من المسارات المثبطة في 6 أو 12 ساعة التحفيز في المختبر (عادة الحال مع العينات البشرية)، الحصار من المستقبلات المثبطة في معظم الحالات لا يغير من وتيرة الاستجابة خلايا T مستضد محددة مقاسا المقايسات ICS القياسية 6، 7. أعطت قياسات الإنتاج خلوى في خلايا مقاسا متوسط أو متوسط كثافة مضان نتائج غير متناسقة 6، 7، 10. من ناحية أخرى، عندما يتم تنفيذ ICS عند نقطة أواخر الوقت بعد التحفيز (أي ستة أيام)، والتغييرات في عدد من إفراز السيتوكينات جويمكن ملاحظة أذرع. الاختلافات هي التأثير المشترك للتغير الانتشار والبقاء، والتغيرات في وظيفة المستجيب التي تتراكم على مدى فترة محددة من الوقت 6. طريقة واحدة للتغلب على هذه القيود جزئيا هو احتضان لفترات أطول من الوقت (على سبيل المثال 36 ساعة، 60 ساعة، الخ.) مع مستضد قبل إضافة مانع إفراز خلوى دون انتظار انتشار تحدث. وقد استخدمنا بنجاح هذا الأسلوب لتحديد حركية إفراز السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية محددة CD4 و CD8 T 11،12، ولكن هذا النهج ليس قادرا على الكشف عن الاستجابات الصغيرة ولن يعطي نتيجة متكاملة من إفراز السيتوكينات مجموع تحدث منذ التحفيز. لذا، ICS ليست طريقة حساسة بما يكفي للكشف عن تأثير الحصار من مسارات المثبطة على كمية من السيتوكينات التي تنتجها الخلايا التائية تفعيلها مقارنة مع خلوى مرنا الكميات أو قياسات من إفراز خلوى في supernatanر في الوقت نفسه نقطة. بالإضافة إلى ذلك، فإن معظم السيتوكينات التي تنتجها الخلايا التائية تنشيط العمل في الأزياء autocrine من خلال المساهمة في ردود فعل إيجابية أو سلبية حلقات عبر التفاعل مع الخلايا مستضد تقديم. لذلك، إضافة Brefeldin أو مونينسين خلال فحص ICS يمنع إفراز السيتوكينات، وبالتالي تحفيز خلايا T ليس الأمثل. أخيرا، كشف عن السيتوكينات متعددة مع ICS محدودة بسبب توافر وحساسية الأجسام المضادة للكشف عن السيتوكينات مع التدفق الخلوي فضلا عن القيود في عدد من fluorochromes التي يمكن استخدامها في وقت واحد في أي لوحة معينة.
قمنا بتطوير نهج حساسة للغاية في المختبر التجريبي لتقييم تأثير مسارات مناعة في تنظيم إفراز السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة وبالتالي CD4 تساعد على تقديم المستضد خلايا (ناقلات الجنود المدرعة) والخلايا القاتلة الطبيعية (الخلايا القاتلة الطبيعية). ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتقييم السلطة الإسرائيليةط الحصار من الجزيئات المثبطة CD8 T على وظيفة الخلية عن طريق استنزاف خلايا CD4 T من PBMCs أو من خلال تحفيز الببتيدات مع الأمثل التي يتم التعرف عليها إلا من خلال خلايا CD8 T. وعلى النقيض من الخلايا تلطيخ خلوى المقايسات، قررنا عدم التدخل في إفراز السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة من أجل أن يكون قادرا على: 1) إجراء تقدير أكثر دقة لمستويات خلوى المنتجة؛ 2) التحقيق في لجنة أوسع السيتوكينات أو الجزيئات المستجيب، و 3) تقييم أثر السيتوكينات التي تنتجها الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة على مجموعات فرعية الخلايا الأخرى. نحن تحفيز PBMCs المنضب CD8 مع HIV-1 الكمامة تجمع الببتيد في وجود أجسام مضادة لعرقلة مسار مناعة من الفائدة. بعد الوقت المطلوب من الحضانة، عادة 48 ساعة، ونحن جمع supernatants لقياس إفراز السيتوكينات مع صفائف حبة وجمع الكريات الخلايا إما لتحليل المظهري من مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا لتحليلها أو النسخي. علما، في رله 48 نقطة زمنية ساعة، ونحن لا كشف عدد كبير من السكان من الخلايا المتكاثرة T 12. هذا هو نهج مرن والعديد من التعديلات من هذا التصميم يمكن تطبيقها لمعالجة الفرضيات المختلفة. على سبيل المثال، مجموعات فرعية الخلايا الفردية (مثل خلايا CD4 T فيروس نقص المناعة البشرية محددة أو PD-1 خلايا CD4 T عالية، الخ.) يمكن فرزها بعد 12 ساعة من الحضانة قبل مزيد من الحضانة لمدة 36 ساعة تليها مجموعة من supernatants وكريات خلية للتحقيق بشكل أكثر تحديدا تأثير التدخلات الحصار على إفراز السيتوكينات من مجموعات سكانية فرعية محددة من PBMCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
جمع طاف هو جزء حتمي من هذا التصميم التجريبي. عندما حصاد supernatants لفحص LUMINEX، أدلى مأخوذة والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية لمنع تدهور البروتين بسبب تجميد أذاب دورات. تجميد والذوبان يمكن أن تكون عمليات قاسية للبروتينات، والتقليل من تجميد يذوب، سيتم مكبر إشارة في المقايسات. ل…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جوردون فريمان لتوفير الحجب الأجسام المضادة لمكافحة PD-L1. نشكر الكادر الطبي والمختبر في مستشفى ماساتشوستس العام وجميع المشاركين في الدراسة لدور لا تقدر بثمن في هذا المشروع.
وأيد هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية التابع لمعاهد الصحة القومية (PO1 AI-080192؛ دك)، والرئة القومي للقلب والدم المعهد من المعاهد الوطنية للصحة (RO1 HL-092565؛ دك). ويدعم دك من قبل جائزة شهادة باحث من صندوق البحوث الصحية كيبيك (FRQS). ويدعم FP من خلال منحة زمالة من ماساتشوستس العام اللجنة التنفيذية مستشفى للبحوث ومعهد هارفارد للصحة العالمية (HGHI).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
References
- Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
- Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).
- Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
- Porichis, F., Kaufmann, D. E. Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy. Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. 12, 492-499 (2011).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443, 350-354 (2006).
- Brockman, M. A., et al. IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells. Blood. 114, 346-356 (2009).
- Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
- Zhang, J. Y., et al. PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors. Blood. 109, 4671-4678 (2007).
- Ndhlovu, Z. M., et al. High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control. Blood. 121, 801-811 (2013).
- Porichis, F., et al. Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade. Blood. 118, 965-974 (2011).
- Kwon, D. S., et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes. 86, 6586-6594 (2012).
