Essai in vitro pour évaluer l&#39;impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

Filippos Porichis; Meghan G. Hart; Jennifer Zupkosky; Lucie Barblu; Daniel E. Kaufmann

doi:10.3791/50821

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Article de méthode

Essai in vitro pour évaluer l'impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

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DOI :

10.3791/50821

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15 octobre 2013

Filippos Porichis^*¹ , Meghan G. Hart^*¹ , Jennifer Zupkosky¹ , Lucie Barblu¹^,² , Daniel E. Kaufmann¹^,²

¹The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, ²Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous avons développé un test in vitro pour étudier le rôle des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH.

Résumé

T épuisement cellulaire est un facteur important de la clairance de l'agent pathogène échoué au cours des infections virales chroniques. Voies immunorégulatoires, comme PD-1 et IL-10, sont régulés à la hausse sur cette exposition de l'antigène en cours et contribuent à la perte de la prolifération, de la fonction cytolytique réduite et altérée la production de cytokines par les cellules T CD4 et CD8. Dans le modèle murin de l'infection par LCMV, l'administration d'anticorps bloquants contre ces deux voies augmentée réponses des lymphocytes T. Cependant, il n'existe actuellement aucun test in vitro pour mesurer l'impact d'un tel blocus sur la sécrétion de cytokines dans des cellules à partir d'échantillons humains. Notre protocole et approche expérimentale nous permettent de quantifier avec précision et efficacité la restauration de la production de cytokines par les lymphocytes T CD4 spécifiques du VIH chez des sujets infectés par le VIH.

Ici, nous décrivons un modèle expérimental in vitro qui permet des mesures de la sécrétion de cytokines par les cellules spécifiques au VIH T CD4 et de leur impact sur les autres cell sous-ensembles. Cellules T CD8 ont été épuisés de sang total et PBMC restantes ont été isolées par la méthode de séparation Ficoll. Les PBMC appauvries en CD8 ont ensuite été incubées avec des anticorps bloquants contre PD-L1 et / ou l'IL-10Rα et, après une stimulation avec une piscine de HIV-1 Gag peptide, les cellules ont été incubées à 37 ° C, 5% CO _2. Après 48 h, le surnageant a été recueilli pour l'analyse des cytokines par les tableaux et les perles culots cellulaires ont été recueillis pour chaque analyse phénotypique par cytométrie de flux ou de l'analyse de la transcription en utilisant la qRT-PCR. Pour une analyse plus détaillée, différentes populations de cellules ont été obtenues par l'épuisement sélective de sous-ensemble à partir de PBMC ou par tri en utilisant la cytométrie en flux avant d'être évalués dans les mêmes essais. Ces méthodes offrent une approche très sensible et spécifique pour déterminer la modulation de la production de cytokines par les cellules T auxiliaires spécifiques de l'antigène et de déterminer les interactions fonctionnelles entre les différentes populations de cellules immunitaires.

Introduction

Au cours des infections virales persistantes, les cellules-T spécifiques virus acquièrent des défauts fonctionnels dans un processus connu sous le nom T épuisement cellulaire. Au début des études in vivo dans le modèle de LCMV murin d'infection virale chronique ont indiqué que les cellules T spécifiques du virus épuisés ont réduit la fonction cytolytique contre les cellules infectées par un virus, perdent leur capacité à proliférer et à présenter une capacité réduite à produire des cytokines telles que l'IL-2, TNF- α et IFN-γ ^1,2. Un réseau complexe de voies immunorégulateurs, tels que PD-1 et l'IL-10, sont régulés à la hausse au cours....