Extraktion und Analyse von Cortisol aus Menschen-und Affen-Haar
Summary
Cortisol (CORT) reichert sich in der wachsenden Haarschaft von Menschen und nicht-menschlichen Primaten. Wir beschreiben Methoden zur Extraktion und Analyse von Haar CORT mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit. Messung von CORT Haar ist besonders für die Beurteilung chronischer Stress über einen Zeitraum von Wochen bis Monaten geeignet.
Abstract
Das Stresshormon Cortisol (CORT) wird langsam in die wachsende Haarschaft von Menschen, nichtmenschliche Primaten und anderen Säugetieren aufgenommen. Wir entwickelten und validierten ein Verfahren zur Extraktion und Analyse CORT von Rhesusaffen Haar und anschließend angepasst diese Methode für die Verwendung mit der menschlichen Kopfhaare. Im Gegensatz zu CORT "point samples" aus Plasma oder Speichel erhalten, bietet Haar CORT eine integrierte Messung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-System (HPA)-Aktivität und damit physiologischen Stress, während der Zeit der Hormon Gründung. Da die menschliche Kopfhaar wächst mit einer durchschnittlichen Rate von 1 cm / Monat, CORT Stufen von Haar Segmente erhalten einige cm in der Länge kann potenziell als Biomarker von Stress über eine Anzahl von Monaten erlebt zu dienen.
In unserem Verfahren wird jede Haarprobe wird zunächst zweimal in Isopropanol gewaschen, um CORT von außerhalb des Haarschaftes, der von Schweiß oder Talg abgelagert hat, zu entfernen. Nach dem Trocknen derProbe wird zu einem feinen Pulver zu brechen das Haar die Proteinmatrix und vergrößern die Oberfläche für die Extraktion zu erden. CORT vom Innenraum des Haarschaftes in Methanol extrahiert wird das Methanol abgedampft, und der Extrakt wird in Assaypuffer rekonstituiert. Heraus CORT zusammen mit Standards und Qualitätskontrollen, wird dann mittels eines sensitiven und spezifischen kommerziell erhältlichen Enzym-Immunoassay (EIA) Kit analysiert. Auslesen von der EIA ist mit CORT pg pro mg pulverisierte Haargewicht umgewandelt. Diese Methode wurde in unserem Labor verwendet worden, um Haar CORT beim Menschen zu analysieren, verschiedene Arten von Makaken-Affen, Krallenaffen, Hunde und Eisbären. Viele Studien sowohl aus unserem Labor und von anderen Forschungsgruppen haben die breite Anwendbarkeit des Haar CORT zur Beurteilung der chronischen Stressbelastung in natürlichen als auch Labor-Einstellungen demonstriert.
Introduction
Mess Cort im Plasma, Speichel, oder gelegentlich in Urin oder Kot wurde als Index der physiologische Stress Selye seit Entdeckung der Rolle der HPA-Achse in Stress 1 verwendet. Obwohl zahlreiche Arbeiten veröffentlicht worden über HPA Aktivität akut belastenden Situationen hat das Feld, das durch das Fehlen einer einfachen und zuverlässigen Index der chronischen physiologischen Stress behindert. Dieses Problem entsteht, weil Plasma und Speichel sowohl Ausbeute als "Punkt" Schätzungen der HPA Tätigkeit, die einer zirkadianen Variation sind und können durch Umweltstörungen verwechselt werden. Harn-und Stuhlproben ergeben Messungen von CORT und / oder Metaboliten-Ausscheidung, die eine Anzahl von Stunden bis zu einem ganzen Tag in einigen Fällen zu überspannen. Sammlung mehrerer Proben mit einer dieser Matrizen können eine grobe Composite-Index der Kortikosteroid-Konzentration im Laufe der Zeit zur Verfügung stellen, jedoch bietet keiner dieser Ansätze einen wirklich langfristigen Index der HPA-Aktivität und die Reaktionsfähigkeit dieser syStammzellen zu chronischen Stressfaktoren.
Mess CORT im Haar hat damit begonnen, diesen wichtigen Bedarf in der Stress-Literatur zu füllen. Erste Studien von verschiedenen Laboratorien zeigte die Anwesenheit von CORT in menschliches Haar, aber nicht untersuchen, ob Haare CORT Stufen in Abhängigkeit von Stress 2 geändert. Als unser Labor hat in der Regulation des Rhesusaffen HPA-Achse durch verschiedene Sozial-und Verhaltensfaktoren 3 interessiert seit vielen Jahren, machten wir uns auf Verfahren zur Extraktion und Analyse von Rhesusaffen Haar 4 zu etablieren und zu validieren. Basierend auf der Annahme, daß Blut übertragbaren Cort langsam und kontinuierlich wachsende Haar eingearbeitet, deren Zweck dieses neuen Verfahrens wurde auf ein Niveau von Haar abgeleitet CORT als integrierte Index von HPA-Aktivität über einen Zeitraum von Wochen bis Monaten zu verwenden.
Mehrere methodischen Herausforderungen in der Entwicklung der vorliegenden Protokoll aufgetreten. Zunächst hatten frühere Studien, dass kleine Mengen o gezeigtf zirkulierenden CORT in Schweiß und Talg ausgeschieden wird und daher Beschichtung der Außenseite der Haarschaft 2. Um dieses Potenzial zu verwechseln eliminieren, entwickelten wir eine milde Waschverfahren, die auf externe CORT entfernen, während eine minimale Auswirkung auf CORT innerhalb der wachsenden Haarschaft vorhanden erscheint. Somit Affenhaar diesem Verfahren (dh zwei 3-minütiges Waschen mit Isopropanol) unterworfen verloren etwa 7-8% der gesamten Haar CORT Gehalt und eine dritte Waschschritt entfernt von weniger als 1% Steroid aus der Probe 4. Es scheint mehrere externe CORT in menschlichen Haaren, da dasselbe Verfahren entfernt einen Durchschnitt von 27% Gesamtgehalt CORT aus den Proben (K. Rosenberg und J. Meyer, unveröffentlicht). Wie Affenhaar, enthielt jedoch eine zusätzliche Wasch weniger CORT (etwa 7%) als die ersten zwei Waschungen. Daher ergibt sich aus beiden Affen-und Menschenhaar unterstützt die Behauptung, dass die meisten (wenn nicht alle) externe CORT entfernt werden kann, während ein Hauptfraktionention von CORT innerhalb der inneren Haarmatrix. Zweitens unsere Pilotstudien zeigten auch, dass die Schleif Haar vor signifikant erhöht CORT Erholung von der Probenextraktions, vermutlich durch Aufbrechen des Komplexes proteinartigen Matrix des Haares sowie die Erhöhung der Oberfläche für das Eindringen von Lösungsmitteln zur Verfügung. Wurden zwei verschiedene Schleifverfahren entwickelt, die jeweils Vor-und Nachteile. Verfahren 1, die eine Kugelmühle verwendet, hat den Vorteil der Herstellung von feinstem Pulver. Allerdings ist eine Kugelmühle eine relativ teure Geräte und Artikel, wenn mit Standard-Mahlbecher und Kugeln verwendet wird, in der Lage, Schleifen nur zwei Proben gleichzeitig ist es. Kleine Proben sind auch schwierig zu verarbeiten unter Verwendung einer Kugelmühle mit Standard Mahlbecher. Methode 2, welche eine BeadBeater verwendet, ist weniger effektiv in ihrer Schleiffähigkeit. Als Ergebnis beträgt die durchschnittliche Rückgewinnungs CORT etwa 10% niedriger mit diesem Verfahren im Vergleich zu der Kugelmühle (unveröffentlichte Daten). Andererseits ist ein BeadBeaterist wesentlich billiger als eine Kugelmühle, kann 16-24 Proben gleichzeitig, je nach Modell gemahlen werden, und das Verfahren ist für kleine Proben gut geeignet. Aufgrund der oben erwähnten Differential Erholung ist es ratsam, das gleiche Schleifverfahren für alle Proben innerhalb einer bestimmten Studie verwendet.
Nachdem die Haarproben verarbeitet worden sind, werden sie mit Methanol und CORT der Extrakte mittels einer sensitiven und spezifischen kommerziellen EIA-Kit ursprünglich zur Speichel CORT Messung analysiert. Die Extraktions-und Testverfahren wurden zum Teil durch die zeigen, dass serielle Verdünnungen der Extrakte aus Affenhaarproben ergab UVP-Messwerte, die die aus authentischen CORT-Standards erhalten Lesungen eng parallel validiert. Wir haben dann gezeigt, dass Haare CORT (zusätzlich zu Plasma-und Speichel CORT) war empfindlich auf die großen Lebens Stressor einer verwaltungs beauftragt Umzug der Affen zu neuen Wohnviertel 4,5. Die Präsentationt Papier liefert eine detaillierte Darstellung der in unserem Labor routinemäßig verwendet werden, um Menschen und Affen Haarproben zu verarbeiten und aus solchen Proben zu extrahieren und zu analysieren, CORT Methoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die oben beschriebenen Haar CORT Verfahren ist einfach durchzuführen, ist relativ preiswert, macht Gebrauch von frei verfügbaren Chemikalien, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien und Geräte benötigt, die, mit einer Ausnahme, wird wahrscheinlich in einem typischen analytischen Labor vorhanden sein. Die Ausnahme ist eine Schleifvorrichtung, wie einer Kugelmühle oder Mini BeadBeater. Wir stellen fest, dass einige Forschungsgruppen Hackfleisch Haarproben in kleine Fragmente etwa 1 mm in der Länge 12, aber a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Kymberlee O'Brien, Celia Moore, und Edward Tronick (Department of Psychology, University of Massachusetts, Boston) für die Bereitstellung der menschlichen Haarproben in dieser Studie analysiert und Stephen Suomi und Amanda Dettmer (Labor für Vergleichende Verhaltensforschung, NICHD) für Bereitstellung der Rhesusaffen Haarproben. Anfängliche Entwicklung und weitere Nutzung dieser Methode wurde von NIH RR11122 MAN unterstützt
Materials
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0-ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2-mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10-ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12-mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rotator for 15-ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipetter | |||
| Analytical balance |
References
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production – Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H., Montagna, W., Dobson, R. L. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. IX, 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. a. n., H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. &. #. 2. 1. 6. ;., Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair – State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
