הפקה וניתוח של קורטיזול מאדם וקוף השיער
Summary
קורטיזול (קורט) מצטבר בשערה הולך וגדל של בני אדם ופרימטים לא אנושיים. אנו מתארים שיטות לחילוץ וניתוח קורט שיער עם דיוק גבוה ורגישות. מדידה של שיער קורט היא טוב במיוחד מתאימה להערכת לחץ כרוני על פני תקופות של שבועות עד חודשים.
Abstract
הורמון לחץ קורטיזול (הקורט) משולב באיטיות לתוך פיר שיער גדל והולך של בני אדם, פרימטים לא אנושיים, ויונקים אחרים. פיתחנו ומאומתים שיטה להפקת קורט וניתוח מקוף רזוס שיער ולאחר מכן הותאם בשיטה זו לשימוש עם שיער קרקפת אנושית. בניגוד ל" דגימות נקודה "קורט מתקבלות מפלזמה או רוק, שיער קורט מספק מדד משולב של פעילות מערכת ההיפותלמוס, יותרת המוח adrenocortical (HPA), ומתח ובכך פיסיולוגי, במהלך תקופת התאגדות הורמון. בגלל שיער קרקפת אנושי גדל בשיעור ממוצע של 1 סנטימטר / חודש, רמות הקורט מתקבלות ממגזרי שיער כמה סנטימטר באורך עלולים לשמש כסמן ביולוגי של לחץ שחווה על פני מספר החודשים.
בשיטה שלנו, כל דגימת שיער נשטפה ראשון פעמיים בisopropanol כדי להסיר כל קורט מהחלק החיצוני של השערה שכבר הופקדה מזיעה או חלב. לאחר ייבוש,מדגם הוא קרקע לאבקה דקה כדי לשבור את מטריצת החלבון של השיער ולהגדיל את שטח הפנים להפקה. קורט מהפנים של השערה מופק לתוך מתנול, מתנול הוא התאדה, ותמציתו מחדש במאגר assay. קורט חילוץ, יחד עם סטנדרטים ובקרת איכות, הוא ניתח אז באמצעות immunoassay אנזים זמין מסחרי רגיש וספציפי ערכה (EIA). קריאת נתוני EIA מומר לקורט pg למשקל שיער אבקת מ"ג. בשיטה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו כדי לנתח קורט שיער בבני אדם, כמה מינים של קופים מקוק, חרגולים, כלבים, ודובי קוטב. מחקרים רבים הן מהמעבדה שלנו ומקבוצות מחקר אחרות הוכיחו את תחולתה הרחבה של קורט שיער להערכת חשיפה ללחץ כרוני בטבעי, כמו גם הגדרות מעבדה.
Introduction
מדידה של קורט בפלזמה, רוק, או לעתים בשתן או צואה שמשה כמדד ללחץ פיסיולוגי מאז הגילוי של Selye על תפקידו של ציר HPA במתח 1. למרות מאמרים רבים שפורסמו נוגעים פעילות HPA למצבים מלחיצים בחריפות, השדה כבר הקשו על ידי חוסר מדד פשוט ואמין של לחץ פיסיולוגי כרוני. בעיה זו נובעת מכך שהערכות פלזמה ורוק גם תשואה "נקודה" של פעילות HPA שחשופים לסטיות היממה ויכול להיות מבולבלת על ידי הפרעות סביבתיות. דגימות שתן וצואה להניב מדידות של קורט ו / או הפרשת המטבוליט כי ההיקף מספר שעות עד יום שלם בחלק ממקרים. איסוף דגימות מרובות באמצעות כל אחת ממטריצות אלו עשוי לספק מדד משולב גס של רמות הקורט לאורך זמן, עם זאת, אף אחת מהגישות הללו מספק מדד באמת לטווח הארוך של פעילות HPA והיענות של סאי זהגזע ללחצים כרוניים.
מדידת קורט בשיער החלה למלא את הצורך החשוב הזה בספרות המתח. מחקרים ראשוניים על ידי מספר מעבדות הפגינו את נוכחותו של קורט בשיער אנושי אך לא לחקור האם רמות קורט שיער השתנו כפונקציה של מתח 2. כמעבדה שלנו כבר מתעניינת שנים רבות בוויסות של ציר HPA קוף רזוס ידי גורמים חברתיים והתנהגותיות שונים 3, יצאנו כדי להקים ולאמת את שיטות להפקה וניתוח של קוף רזוס שיער 4. בהתבסס על ההנחה שהקורט נישא בדם משולב באיטיות וברציפות לשיער גדל, מטרת השיטה החדשה הייתה להשתמש ברמות של קורט שמקורם בשיער כמדד משולב של פעילות HPA על פני תקופות של שבועות עד חודשים.
כמה אתגרים מתודולוגיים נתקלו בפיתוח הפרוטוקול הנוכחי. ראשית, מחקרים קודמים הראו כי o כמויות קטנותו במחזור הקורט מופרשים בזיעה וחלב ולכן יכול מעיל החיצוני של השיער פיר 2. כדי לחסל לבלבל את הפוטנציאל הזה, פיתחנו הליך לשטוף קל שמופיע כדי להסיר קורט חיצוני עם השפעה מינימאלית על קורט נוכחת בתוך השערה הולך וגדל. לפיכך, קוף השיער נתון להליך זה (כלומר שתי שטיפות 3 דקות עם isopropanol) איבד כ 7-8% מכלל תוכן קורט שיער, ולשטוף שלישי הוסר פחות מ 1% יותר מסטרואידי המדגם 4. נראה שיש קורט חיצוני יותר בשיער אנושי, שכן באותו ההליך הוסר ממוצע בסך הכל 27% תוכן קורט מהדגימות (ק רוזנברג וג' מאייר, לא פורסמו). כמו קוף שיער, לעומת זאת, שטיפה נוספת הכילה הרבה פחות קורט (כ -7%) מאשר שתי שטיפות הראשונות. לכן, תוצאות משני קוף ושיער אנושי לתמוך בטענה שרוב (אם לא כל) קורט החיצוני ניתן להסיר תוך שמירת frac גדולtion של קורט בתוך מטריצת השיער הפנימית. שנית, מחקרי הפיילוט שלנו הראו גם כי שחיקה השיער לפני מיצוי התאוששות קורט גדלה באופן משמעותי מהמדגם, ככל הנראה על ידי השבירה פתוחה המטריצה חלבוניים המורכבת של השערה כמו גם להגדיל את השטח זמין לחדירת ממס. שתי שיטות שחיקה שונות פותחו, כל אחד עם יתרונות וחסרונות. יש שיטה 1, אשר עושה שימוש בטחנת כדור, היתרון של ייצור האבקה הטובה ביותר. עם זאת, טחנת כדור היא פריט ציוד יקר יחסית, ואם משתמש עם צנצנות טחינה סטנדרטיות וכדורים, הוא מסוגל טחינה רק שתי דגימות בכל פעם. דגימות קטנות הן גם קשות לעבד באמצעות טחנת כדור עם צנצנות טחינה רגילות. השיטה 2, אשר משתמשת beadbeater, היא פחות יעילה ביכולת הטחינה שלו. כתוצאה מכך, התאוששות קורט ממוצעת היא כ 10% נמוך יותר בשיטה זו בהשוואה לטחנת הכדור (נתונים שלא פורסמו). מצד השני, beadbeaterהוא הרבה פחות יקר מאשר טחנת כדור, יכולות להיות קרקע 16-24 דגימות בפעם בהתאם לדגם, והשיטה היא גם מתאימה למדגמים קטנים. בשל התאוששות ההפרש שהוזכר לעיל, רצוי להשתמש באותה השיטה שחיקה עבור כל הדגימות במחקר מסוים.
ברגע שדגימות השיער עברו עיבוד, הם חולצו עם מתנול וקורט בתמציות הוא מנותח באמצעות ערכת EIA מסחרית רגישה וספציפית שנועדה במקור למדידת קורט רוק. נהלי החילוץ וassay אומתו בחלקו על ידי הוכחת כי דילולים סדרתי של תמציות מדגימות קוף שיער הניבו קריאות EIA שדומות מאוד לקריאות המתקבלות מסטנדרטים קורט אותנטיים. לאחר מכן, אנו הראו כי קורט שיער (בנוסף לפלזמה וקורט רוק) היה רגיש ללחץ הגדול בחיים של רילוקיישן מנדט מנהלי של הקופים לרבעוני דיור חדשות 4,5. Presenנייר לא מספק תיאור מפורט של השיטות המשמשות באופן שיגרתי במעבדה שלנו לעבד את דגימות שיער אדם וקוף ולחלץ ולנתח קורט מדוגמאות כאלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הליך קורט שיער שתואר לעיל הוא פשוט לביצוע, הוא זול יחסית, הופך את השימוש בכימיקלים זמינים, חומרים כימיים, ואספקה, ודורש ציוד זה, למעט במקרה אחד, עשוי להיות נוכח במעבדה האנליטית טיפוסית. יוצא מן הכלל הוא מנגנון שחיקה כגון טחנת כדור או מיני beadbeater. נציין כי חלק מקבוצות המח?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Kymberlee אובריאן, סיליה מור, ואדוארד Tronick (חוג לפסיכולוגיה, אוניברסיטת מסצ'וסטס, בוסטון) עבור מתן דגימות שיער האנושיות נותחו במחקר זה, וסטיבן תיירות ואמנדה Dettmer (מעבדה של השוואתית אתולוגיה, NICHD) עבור מתן דגימות שיער קוף רזוס. פיתוח ראשוני והמשך שימוש בשיטה זו כבר נתמכה על ידי NIH RR11122 לMAN
Materials
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0-ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2-mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10-ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12-mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rotator for 15-ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipetter | |||
| Analytical balance |
References
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production – Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H., Montagna, W., Dobson, R. L. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. IX, 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. a. n., H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. &. #. 2. 1. 6. ;., Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair – State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
