Isolamento di polmonare cellule muscolari lisce di topi neonati
Summary
Abbiamo sviluppato una nuova tecnica e riproducibile per isolare colture primarie di cellule muscolari lisce delle arterie polmonari (PASMC) da topi giovani come P7, consentendo in tal modo una migliore studio delle vie di segnalazione coinvolte nella contrazione delle cellule muscolari lisce neonatale e relax.
Abstract
L'ipertensione polmonare è una causa importante di morbilità e mortalità nei neonati. Storicamente, sono stati fatti significativi studio delle vie di segnalazione coinvolte nella contrazione del muscolo liscio vascolare in PASMC di pecora fetale. Mentre pecore fanno un eccellente modello di ipertensione polmonare termine, sono molto costosi e non hanno il vantaggio di manipolazione genetica presente nei topi. Viceversa, l'incapacità di isolare PASMC da topi era una limitazione significativa di tale sistema. Qui abbiamo descritto l'isolamento di colture primarie di topo PASMC da P7, P14, P21 e topi utilizzando una variazione della tecnica precedentemente descritta di Marshall et al. 26 precedentemente utilizzato per isolare ratto PASMC. Questi PASMC murino rappresentare un nuovo strumento per lo studio delle vie di segnalazione nel periodo neonatale. Brevemente, un impasto di 0,5% (w / v) di agarosio + 0,5% di particelle di ferro in M199 media sta infuse nel letto vascolare polmonare attraverso il ventricolo destro (RV). Gliparticelle di ferro sono 0,2 micron di diametro e non possono passare attraverso il letto capillare polmonare. Così, le logge di ferro nelle piccole arterie polmonari (PA). I polmoni sono gonfiati con agarosio, rimosso e dissociato. I vasi contenenti ferro sono tirato giù con una calamita. Dopo collagenasi (80 U / ml) e l'ulteriore trattamento dissociazione, i vasi vengono posti in coltura tissutale in piatto M199 terreni contenenti il 20% di siero fetale bovino (FBS) e antibiotici (M199 mezzi completi) per consentire la migrazione delle cellule nel piatto di coltura . Questa piastra iniziale di cellule è una miscela 50-50 di fibroblasti e PASMC. Così, la discesa procedura è ripetuta più volte per ottenere una popolazione PASMC più puro e rimuovere eventuali residui di ferro. Smooth identità delle cellule muscolari è confermata da immunoistochimica per la muscolatura liscia e miosina desmin.
Introduction
Ipertensione polmonare è normale durante la vita intrauterina poiché la placenta funge da organo principale di scambio di gas e solo il 10% della gittata cardiaca viene fatto circolare attraverso il letto vascolare polmonare. In utero, pressione polmonare sono simili alle pressioni sistemiche dovute a elevata resistenza vascolare polmonare . Come gestazione progredisce, vi è una rapida crescita del piccolo PA all'interno del polmone, preparando il feto per il drammatico aumento del flusso sanguigno polmonare che si verifica alla nascita 1. Quando la normale transizione perinatale fallisce nei neonati a breve termine e pieno termine, il risultato è l'ipertensione polmonare persistente del neonato (PPHN). PPHN è una sindrome clinica causata da molte diverse patologie sottostanti. Tuttavia, tutti questi bambini condividono caratteristiche fisiopatologiche comuni come l'elevata resistenza vascolare polmonare, ipossiemia, e shunt da destra a sinistra del flusso di sangue attraverso le connessioni persistenti fetali come il dotto arterioso o peramen ovale. PPHN colpisce 2-6 per 1.000 nati vivi e trasmette un rischio 8-10% di mortalità, così come significative a breve termine e lungo termine morbilità 2. Inoltre, molto basso peso alla nascita i neonati prematuri possono sviluppare ipertensione polmonare come conseguenza della loro malattia polmonare sottostante. La più comune malattia polmonare sottostante dei neonati prematuri è displasia broncopolmonare (BPD). Mentre il rischio complessivo di BPD è correlata con l'età gestazionale e peso alla nascita, non è chiaro perché un sottoinsieme di questi bambini si sviluppa ipertensione polmonare significativa e come trattare in modo appropriato questi bambini. Scarsi risultati, tra ricoveri ospedalieri prolungati e aumento della mortalità, sono comuni 3-6.
Storicamente, ovina PASMC fetale o suina PASMC fetale da animali sani sono stati utilizzati per studiare le vie di segnalazione coinvolte nel normale transizione vascolare polmonare dopo la nascita. Questi sono tipicamente isolati da quinta resistenza PA generazione di unn ovina o suina feto che viene consegnato ed eutanasia prima di ogni respirazione spontanea 7-9. Inoltre, alcuni ricercatori hanno isolato e utilizzato PASMC da leggermente più vecchio e respiro spontaneo agnelli e maialini a 3 giorni, 2 settimane e 4 settimane 10-12. Più recentemente, alcuni gruppi hanno isolato con successo ed utilizzato PASMC isolato da agnelli con PPHN per esaminare le alterazioni in vie di segnalazione dello stato della malattia 13-17. Queste cellule hanno dimostrato di essere un valido strumento per esaminare quali vie di segnalazione sono cruciali sia nel sistema vascolare polmonare normale e malato breve termine e durata. Tuttavia, essi non danno comprensione nei percorsi di segnalazione impattati nei neonati prematuri con ipertensione polmonare. Né permettono le possibilità di manipolazione genetica visto in modelli murini di malattia.
Modelli di ratto e di topo sono stati a lungo utilizzati per modello BPD e più di recente vengono utilizzati per hy polmonare modellopertension derivanti da BPD 18-22. Ratti neonati sono allettanti per lavorare con per la loro dimensione più grande, ma soffrono anche per la mancanza di potenziale di modificazione genetica. Animali geneticamente modificati sono stati ampiamente utilizzati per studiare gli effetti di specifici obiettivi del gene su tutta la fisiologia degli animali in topi neonati, ma fino ad oggi nessuno ha precedentemente isolato con successo PASMC da questi piccoli topi. Isolando PASMC, maggiori informazioni sono disponibili su come percorsi cambiano in risposta a stimoli ambientali e / o di modificazione genetica in particolare nella muscolatura liscia arteriosa polmonare. Ulteriormente, vivo PASMC può essere ripreso in tempo reale per esaminare rapidi cambiamenti molecole di segnalazione chiave come calcio e specie reattive 23-25. Recentemente abbiamo descritto l'isolamento di successo di PASMC da topi adulti utilizzando una variazione della tecnica di Marshall et al. 26 usato per isolare ratto PASMC 23,25,26. Ora abbiamo adattato unnd esteso questa tecnica per piccoli topi 7-21 giorni di età (P7, P14 e P21). Il limite principale di questa nuova tecnica di isolamento PASMC è che richiede mouse multipli per generare cellule sufficiente per esperimenti e che le cellule crescono molto lentamente, che è caratteristica delle cellule muscolari lisce primarie. Nonostante questi limiti, crediamo che questa tecnica per isolare neonatale PASMC del mouse consentirà la migliore ricerca delle vie di segnalazione chiave coinvolti nello sviluppo di ipertensione polmonare e rappresenta un significativo passo avanti in questo campo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, si descrive per la prima volta l'isolamento di PASMC da topi a P7, P14, e P21. Per ottenere questo risultato, un impasto di agarosio e 0,2 particelle di ferro m sono infusa attraverso il camper nella PA. A causa della piccola dimensione delle particelle di ferro, non possono passare attraverso il letto capillare polmonare e sono quindi depositati nel piccolo PA. I polmoni sono gonfiati, rimossi e dissociato. I vasi contenenti ferro sono estratti di soluzione con un magnete. In definitiva, i va…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH HL109478 (KNF). Gli autori riconoscono e ringraziano Gina Kim e Joann Taylor per la loro assistenza a isolare e mantenere il PASMC nella cultura.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
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