Выделение легочной артерии гладкомышечных клеток у новорожденных мышей
Summary
Мы разработали новый и воспроизводимой техники для изоляции первичных культурах легочной артерии гладкомышечных клеток (PASMC) от мышей в возрасте P7, что позволяет лучше изучения сигнальных путей, участвующих в неонатальном сокращение гладких мышечных клеток и релаксации.
Abstract
Легочная гипертензия является одной из основных причин заболеваемости и смертности у детей. Исторически сложилось, что имело место значительное изучения сигнальных путей, участвующих в сосудистых гладких мышц в PASMC от плода овцы. В то время как овцы сделать отличную модель термин легочной гипертензии, они очень дорогие и не имеют преимущества генетических манипуляций нашли у мышей. И наоборот, невозможность изолировать PASMC от мышей значительное ограничение этой системы. Здесь мы описали выделение первичных культурах мышь PASMC от Р7, Р14, Р21 и мышей с использованием изменения ранее описанных техники Marshall и соавт. 26, который ранее был использован для изоляции крысы PASMC. Эти мышиный PASMC представляют собой новый инструмент для изучения путей передачи сигналов в неонатальном периоде. Вкратце, суспензию 0,5% (м / о) агарозном + 0.5% частиц железа в M199 медиа вливается в легочной сосудистого русла через правый желудочек (RV).частицы железа 0,2 мкм в диаметре и не может пройти через легочную капиллярного русла. Таким образом, железо лож в небольших легочных артерий (ПА). Легкие надуваются агарозы, удалены и диссоциированных. Железосодержащих суда снесены с помощью магнита. После коллагеназы (80 ед / мл) очистки и дальнейшей диссоциации, сосуды помещают в чашку для культуры ткани в M199 среде, содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотики (M199 полной среде), чтобы позволить миграции клеток на чашку для культивирования . Этот начальный пластине клеток 50-50 смесь фибробластов и PASMC. Таким образом, выпадающее процедура повторяется несколько раз, чтобы получить более чистый PASMC населения и удаления остаточного железа. Гладкая мышечная клетка идентичности подтверждается иммуноокрашивания для гладких мышц миозин и десмин.
Introduction
Легочной гипертензии во время нормальной внутриутробной жизни, так как плацента служит основным органом газообмена и только 10% от сердечного выброса циркулирует через легочные сосудистые кровать. В утробе матери, легочные давления аналогичны системного давления из-за повышенной легочной сосудистое сопротивление . Как беременность прогрессирует, наблюдается бурный рост малых PA в легких, что готовит для плода резкое увеличение легочного кровотока, которое происходит при рождении 1. Когда нормальные перинатальные переход терпит неудачу в краткосрочной и доношенных новорожденных, то в результате постоянной легочной гипертензии у новорожденных (PPHN). PPHN это клинический синдром, вызванный много различных основных патологий. Однако, все эти дети имеют общие патофизиологические особенности, такие как повышенное легочное сосудистое сопротивление, гипоксемии и право-налево шунтирование кровотока плода стойких соединений, таких как открытый артериальный проток илиАминь овальное. PPHN влияет 2-6 на 1000 живорожденных и передает 8-10% риска смертности, а также значительные краткосрочные и долгосрочные заболеваемости 2. Кроме того, очень низкий вес при рождении недоношенных детей может развиться легочная гипертензия в результате их основное заболевание легких. Наиболее распространенными основного заболевания легких недоношенных детей бронхолегочной дисплазии (БЛД). Хотя общий риск БЛД коррелирует с гестационного возраста и массы тела при рождении, остается непонятным, почему подмножество этих детей развивается значительное легочной гипертензии и, как надлежащим образом относиться к этим детям. Неблагоприятные исходы, в том числе длительные госпитализации и повышенной смертности, являются общими 3-6.
Исторически сложилось так, фетального овечьего PASMC или свиной фетальной PASMC от здоровых животных были использованы для изучения сигнальных путей, участвующих в нормальных легочных сосудов переход после рождения. Как правило, они изолированы от пятой PA сопротивление поколенияN овечий или свиной плода, которая поставляется и эвтаназии до любого спонтанного дыхания 7-9. Кроме того, некоторые исследователи выделили и использовали PASMC от чуть старше и спонтанном дыхании ягнят и поросят на 3 дня, 2 недели и 4 недели 10-12. В последнее время некоторые группы успешно выделены и использованы PASMC изолированы от ягнят с PPHN для изучения расстройств в сигнальных путях в болезненном состоянии 13-17. Эти клетки оказались ценным инструментом для изучения сигнальных путей, которые имеют решающее значение как в нормальной и больной краткосрочные и срочные легочных сосудах. Тем не менее, они не дают представления о сигнальных путях воздействия у недоношенных детей с легочной гипертензией. Они также не позволяют возможности генетической манипуляции видно на модели мыши заболевания.
Крысы и мыши модели уже давно используются для моделирования баррелей в сутки, в последнее время используются для модели HY легочнойpertension результате BPD 18-22. Новорожденных крыс соблазняют работать с из-за их больших размеров, но они также страдают от недостатка потенциал для генетической модификации. Генетически модифицированные животные широко используются для исследования влияния конкретных задач гена на весь физиологии животных у новорожденных мышей, но на сегодняшний день никто не ранее успешно изолированы PASMC из этих маленьких мышей. Выделяя PASMC, больше информации можно получить о том, как изменить пути в ответ на стимулы окружающей среды и / или генетической модификации в частности, в легочной артерии гладкие мышцы. Кроме того, живые PASMC могут быть отображены в режиме реального времени для изучения быстрых изменений в ключевых сигнальных молекул, таких как кальций и активные формы кислорода 23-25. Недавно мы описали успешная изоляции PASMC от взрослых мышей с использованием варианта техники Marshall и соавт. 26 используется для изоляции крысы PASMC 23,25,26. Теперь мы приспособилисьй распространил эту технику для небольших мышей 7-21 дневного возраста (P7, P14, P21 и). Основным ограничением к этой новой технике PASMC изоляции является то, что он требует несколько мышей генерировать достаточный клеток для экспериментов и, что клетки растут очень медленно, что характерно для первичного гладкомышечных клеток. Несмотря на эти ограничения, мы считаем эту технику, чтобы изолировать новорожденных PASMC мыши позволит расширенные исследования ключевых сигнальных путей, участвующих в развитии легочной гипертензии и представляет собой значительный шаг вперед в этой области.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи мы описываем впервые изоляции PASMC от мышей на Р7, Р14 и Р21. Для того чтобы достичь этого, суспензии агарозы и 0,2 мкМ частиц железа переплетаются через RV в ПА. Из-за небольшого размера частиц железа, они не могут пройти через легочную капиллярную и, таким образом, хранение в не?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH HL109478 (КФН). Авторы признают и благодарят Джина Ким Тейлор и Джоан за помощь в выделении и сохранении PASMC в культуре.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
- Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
- Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
- Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
- Jobe, A. H., Bancalari, E. Bronchopulmonary dysplasia. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1723-1729 (2001).
- Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
- Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
- Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
- Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
- Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
- Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
- Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
- Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
- Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
- Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
- Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
- Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
- Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
- Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
- Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
- de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
- de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30 (2009).
- Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
- Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
- Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
- Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
- Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).
