El aislamiento de la arteria pulmonar células musculares lisas de los ratones recién nacidos
Summary
Hemos desarrollado una técnica novedosa y reproducibles para aislar los cultivos primarios de células musculares lisas de las arterias pulmonares (PASMC) a partir de ratones tan jóvenes como de P7, permitiendo de ese modo un mejor estudio de las vías de señalización implicadas en la contracción de las células del músculo liso neonatal y relajación.
Abstract
La hipertensión pulmonar es una causa importante de morbilidad y mortalidad en recién nacidos. Históricamente, ha habido estudio significativo de las vías de señalización implicadas en la contracción del músculo liso vascular en PASMC de oveja fetal. Mientras ovejas crea un excelente modelo de hipertensión pulmonar plazo, que son muy caros y carecen de la ventaja de la manipulación genética que se encuentra en ratones. Por el contrario, la incapacidad de aislar PASMC de los ratones era una limitación significativa de ese sistema. Aquí hemos descrito el aislamiento de cultivos primarios de ratón PASMC desde P7, P14, y P21 ratones usando una variación de la técnica descrita anteriormente de Marshall et al. 26 que se utilizó anteriormente para aislar PASMC rata. Estos PASMC murino representan una nueva herramienta para el estudio de las vías de señalización en el período neonatal. Brevemente, una suspensión de 0,5% (w / v) de agarosa + 0,5% de partículas de hierro en medio M199 se infunden en el lecho vascular pulmonar a través del ventrículo derecho (VD). Lapartículas de hierro son 0,2 m de diámetro y no pueden pasar a través del lecho capilar pulmonar. Por lo tanto, las logias de hierro en las pequeñas arterias pulmonares (PA). Los pulmones se inflan con agarosa, y se disocia. Los vasos que contienen hierro se tiran hacia abajo con un imán. Después de la colagenasa (80 U / ml) el tratamiento y aún más la disociación, los vasos se colocan en un plato de cultivo de tejidos en medio M199 que contienen 20% de suero bovino fetal (FBS), y antibióticos (medio M199 completos) para permitir la migración de células en la placa de cultivo . Esta placa inicial de las células es una mezcla 50-50 de fibroblastos y PASMC. Por lo tanto, el procedimiento de extracción hacia abajo se repite varias veces para lograr una población PASMC más pura y eliminar todo el hierro residual. Identidad de la célula del músculo liso se confirmó mediante inmunotinción para la miosina del músculo liso y desmina.
Introduction
La hipertensión pulmonar es normal durante la vida intrauterina desde la placenta sirve como el principal órgano de intercambio de gas y se hace circular sólo el 10% del gasto cardíaco a través del lecho vascular pulmonar. En el útero, las presiones pulmonares son similares a las presiones sistémicas debido a la elevación de la resistencia vascular pulmonar . Como gestación progresa, hay un rápido crecimiento de la pequeña PA dentro del pulmón, la preparación del feto para el dramático aumento en el flujo sanguíneo pulmonar que se produce en el nacimiento 1. Cuando la transición perinatal normal de falla en los bebés a corto plazo y de plazo completo, el resultado es la hipertensión pulmonar persistente del recién nacido (PPHN). HPP es un síndrome clínico causado por diferentes patologías de base. Sin embargo, todos estos lactantes comparten características fisiopatológicas comunes, tales como elevada resistencia vascular pulmonar, hipoxemia, y derivación de derecha a izquierda del flujo de sangre a través de conexiones fetales persistentes, tales como el conducto arterioso o paraAmén ovale. PPHN afecta a 2-6 por cada 1.000 nacidos vivos y transmite un riesgo 8-10% de la mortalidad y la morbilidad significativa a corto plazo y largo plazo 2. Además, los bebés prematuros de muy bajo peso pueden desarrollar hipertensión pulmonar como resultado de su enfermedad pulmonar subyacente. La enfermedad pulmonar subyacente más común de los bebés prematuros es la displasia broncopulmonar (DBP). Mientras que el riesgo general de BPD se correlaciona con la edad gestacional y el peso al nacer, no está claro por qué un subconjunto de estos niños desarrollan hipertensión pulmonar importante y cómo tratar adecuadamente a estos niños. Los malos resultados, incluyendo estancias hospitalarias prolongadas y aumento de la mortalidad, son comunes 3-6.
Históricamente, PASMC fetal ovina o PASMC fetal porcino procedente de animales sanos se han utilizado para estudiar las vías de señalización implicadas en la transición vascular pulmonar normal después del nacimiento. Estos son típicamente aislados de resistencia PA de quinta generaciónn ovina o porcina feto que se entrega y sacrificados antes de cualquier respiración espontánea 7-9. Además, algunos investigadores han aislado y utilizado PASMC desde un poco más viejo y con respiración espontánea corderos y lechones a los 3 días, 2 semanas y 4 semanas 10-12. Más recientemente, algunos grupos han aislado y utilizado con éxito PASMC aislado de corderos con hipertensión pulmonar persistente para examinar las alteraciones en las vías de señalización en el estado de la enfermedad 13-17. Estas células han demostrado ser una herramienta valiosa para estudiar las vías de señalización que son cruciales tanto en la vasculatura pulmonar normal y enfermo a corto plazo y de plazo. Sin embargo, no se dan una idea de las vías de señalización afectadas en los bebés prematuros con hipertensión pulmonar. Tampoco permiten que las posibilidades de manipulación genética visto en los modelos de ratón de la enfermedad.
Modelos de rata y el ratón han sido utilizados para modelar BPD y más recientemente se están utilizando para modelar hy pulmonarpertensión resultante de BPD 18-22. Ratas neonatales son muy atractivos para trabajar con debido a su mayor tamaño, sino que también sufren de falta de potencial para la modificación genética. Los animales genéticamente modificados se han utilizado ampliamente para investigar los efectos de los objetivos específicos de genes en la fisiología animal entero en ratones recién nacidos, pero hasta la fecha nadie ha aislado previamente con éxito PASMC de estos pequeños ratones. Al aislar PASMC, mayor información se puede obtener acerca de cómo las vías cambian en respuesta a los estímulos ambientales y / o la modificación genética específicamente en el músculo liso de la arteria pulmonar. Además, en vivo PASMC se pueden obtener imágenes en tiempo real para examinar los cambios rápidos en las moléculas de señalización clave, tales como el calcio y las especies reactivas de oxígeno 23-25. Recientemente hemos descrito el aislamiento con éxito de PASMC a partir de ratones adultos usando una variación de la técnica de Marshall et al. 26 utilizado para aislar rata PASMC 23,25,26. Ahora hemos adaptado unND extendió esta técnica para pequeños ratones 7-21 días de edad (P7, P14, y P21). La principal limitación de esta nueva técnica de aislamiento PASMC es que requiere varios ratones para generar suficientes células para los experimentos y que las células crecen muy lentamente, lo que es característico de las células musculares lisas primarias. A pesar de estas limitaciones, creemos que esta técnica para aislar neonatal PASMC ratón permitirá la mayor investigación sobre las vías de señalización clave que participan en el desarrollo de la hipertensión pulmonar y representa un avance significativo en este campo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, se describe por primera vez el aislamiento de PASMC a partir de ratones en P7, P14, y P21. Con el fin de lograr esto, una suspensión de agarosa y 0,2 partículas de hierro mu M se infunden a través de la RV en la PA. Debido al pequeño tamaño de las partículas de hierro, que no pueden pasar a través del lecho capilar pulmonar y por lo tanto se deposita en la pequeña PA. Los pulmones se inflan, y se disocia. Los vasos que contienen hierro se sacan de la solución utilizando un imán. En última …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH HL109478 (KNF). Los autores reconocen y agradecen a Gina Kim y Joann Taylor por su ayuda en el aislamiento y el mantenimiento de la PASMC en la cultura.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
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