Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter Düz Kas Hücre İzolasyonu
Summary
Biz, böylece yeni doğan düz kas hücresi kasılma ve gevşeme dahil sinyal yollarının daha iyi çalışma izin olarak, yeni ve P7 kadar küçük farelerden pulmoner arter düz kas hücrelerinin primer kültürleri (PASMC) izole etmek için kullanışlı bir teknik geliştirdik.
Abstract
Pulmoner hipertansiyon morbidite ve bebeklerde mortalite önemli bir nedenidir. Tarihsel olarak, fetal koyun PASMC vasküler düz kas kasılması yer alan sinyal yollarının önemli bir çalışma olmuştur. Koyun vadeli pulmoner hipertansiyon mükemmel bir model yaparken, çok pahalı ve farelerde bulunan genetik manipülasyon avantajı eksikliği. Tersine, fareler PASMC izole etmek yetersizlik, bu sistemin önemli bir sınırlama oldu. Burada Marshall et al daha önce anlatılan tekniğin bir varyasyonu kullanılarak P7, P14 ve P21 farelerden fare PASMC birincil kültürleri izole edilmesi tarif. 26 önceden sıçan PASMC izole etmek için kullanılır oldu. Bu fare PASMC yenidoğan döneminde sinyal yolları çalışmaları için yeni bir araç temsil eder. Kısaca,% 0.5 'lik bir çamur (ağ / hac) agaroz + M199 ortamı içinde% 0.5 demir partikülleri, sağ ventrikül (RV) ile pulmoner vasküler yatak içine aşılanmıştır.demir parçacıkları çapı 0.2 mcM ve pulmoner kapiller yatak geçemez. Böylece, küçük pulmoner arter (PA) demir zâviye. Akciğerler kaldırıldı ve ayrışmış agaroz, şişirilir. Demir içeren gemiler bir mıknatıs ile aşağı çekilir. Kolajenaz (80 U / ml) daha fazla işleme ve ayrışma sonra kaplar kültür kabı üzerine hücre göçü izin vermek için% 20 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotikler (M199 tam kültür ortamı) ihtiva eden M199 ortamı içinde, bir doku kültürü kabı içine konur . Bu hücre ilk plaka fibroblastlar ve PASMC bir 50-50 karışımıdır. Bu nedenle, prosedür aşağı çekme bir daha saf PASMC nüfus elde etmek ve herhangi bir kalıntı demir kaldırmak için birden çok kez tekrarlanır. Düz kas hücre kimlik düz kas miyozin ve desmin için immün ile teyit edilir.
Introduction
Plasenta gaz değişimi en önemli organı olarak hizmet verir ve kalp debisi sadece% 10 pulmoner vasküler yatak dolaşıyor yana Pulmoner hipertansiyon intrauterin ömrü boyunca normaldir. Utero olarak, akciğer basıncı yüksek pulmoner vasküler direnç nedeniyle sistemik basınçları benzer . Gebelik ilerledikçe, akciğer içindeki küçük PA hızlı büyüme doğum 1 gerçekleşir pulmoner kan akımında dramatik artış için fetus hazırlanıyor vardır. Normal perinatal geçiş kısa vadeli ve tam süreli bebeklerde başarısız olduğunda, sonuç (PPHN) yenidoğanın persistan pulmoner hipertansiyon. PPHN çok farklı altta yatan patolojiler neden olduğu bir klinik sendromdur. Ancak, bu bebeklerin tüm bu duktus arteriozus veya için kalıcı fetal bağlantıları arasındaki bu yüksek pulmoner vasküler direnç, hipoksemi ve kan akımının sağdan sola şant gibi ortak patofizyolojik özellikleri paylaşmakovale amin. PPHN 1000 canlı doğumda 2-6 etkiler ve ölüm gibi önemli kısa vadeli ve uzun vadeli morbidite 2 bir% 8-10 risk taşır. Ayrıca, çok düşük doğum ağırlıklı prematüre bebeklerde altta yatan akciğer hastalığı sonucu pulmoner hipertansiyon gelişebilir. Prematüre bebeklerde en sık altta yatan akciğer hastalığı bronkopulmoner displazi (BPD) 'dir. BPD genel risk gebelik yaşı ve doğum ağırlığı ile ilişkilidir ise bu bebeklerin bir alt kümesi önemli pulmoner hipertansiyon ve nasıl uygun bu bebeklerin tedavisinde geliştirir neden, belirsizliğini koruyor. Uzun süreli hastanede kalış ve artan ölüm de dahil olmak üzere kötü sonuçlar, 3-6 yaygındır.
Tarihsel olarak, sağlıklı hayvanlardan alınan koyun veya domuz fetal PASMC fetal PASMC doğumdan sonra normal pulmoner vasküler geçiş dahil sinyal yollarının incelemek için kullanılmıştır. Bunlar, tipik olarak, bir beşinci nesli direnç PA izole edilirn koyun ya da herhangi bir spontan solunum 7-9 önce teslim ve ötenazi domuz fetus. Ayrıca, bazı araştırmacılar izole ve biraz büyük gelen PASMC kullanılan ve kendiliğinden 3 gün, 2 hafta ve 4 hafta 10-12 kuzu ve domuz nefes var. Daha yakın zamanda, bazı grupları başarıyla izole edilmiş ve hastalık durumunun 13-17 yolaklarının sinyalizasyon bozuklukların incelemek PPHN Kuzuların izole PASMC faydalanmaktadır. Bu hücreler sinyal yolları normal ve hastalıklı kısa vadeli ve dönem pulmoner vasküler hem de çok önemli olan incelemek için değerli bir araç olduğu görüldü. Ancak, pulmoner hipertansiyon ile prematüre bebeklerde etkiledi sinyal yolları hakkında fikir vermeyin. Ne de hastalığın fare modellerinde görülen genetik manipülasyon olanakları izin veriyoruz.
Sıçan ve fare modelleri uzun modeli BPB için kullanılmıştır ve daha yakın zamanlarda modeli pulmoner hy için kullanılmaktadırBPD 18-22 kaynaklanan pertension. Yenidoğan sıçan onların büyük boyutu nedeniyle çalışmak için cazip, ama onlar da genetik modifikasyon için potansiyel eksikliği muzdarip. Genetiği değiştirilmiş hayvanlar kapsamlı yenidoğan farelerde bütün hayvan fizyolojisi ile ilgili özel gen hedefleri etkilerini araştırmak için, ama kimse daha önce başarılı bir şekilde bu küçük fareler PASMC izole bugüne kadar kullanılmıştır. PASMC izole ederek, daha fazla bilgi yolları çevresel uyaranlara ve / veya pulmoner arter düz kas özellikle genetik modifikasyon yanıt olarak nasıl değiştiğini hakkında elde edilebilir. Ayrıca, canlı PASMC kalsiyum ve reaktif oksijen türleri 23-25 gibi önemli sinyal molekülleri hızlı değişiklikleri incelemek için gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. Son zamanlarda Marshall et al, tekniğin bir varyasyonu kullanılarak erişkin farelerden elde edilen PASMC başarılı bir şekilde izole edilmesi tarif. 26 sıçan PASMC 23,25,26 izole etmek için kullanılabilir. Şimdi bir adapte olmasınd 7-21 gün yaş küçük fareler (P7, P14, ve P21) için bu tekniği uzatıldı. Bu yeni PASMC izolasyon tekniği için birincil sınırlama bu deneyler için yeterli hücre elde etmek için birden fazla farenin gerektirir ve hücrelerin, birincil düz kas hücrelerinin karakteristik olan, çok yavaş bir şekilde bu olmasıdır. Bu kısıtlamalara rağmen, biz yenidoğan fare PASMC izole etmek için bu tekniği pulmoner hipertansiyon gelişiminde rol oynadığı ve bu alanda önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir önemli sinyal yollarının gelişmiş soruşturma için izin inanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, ilk kez P7, P14, ve P21 de farelerden alınan PASMC en izolasyonu için tarif. Bunu gerçekleştirmek için, agaroz ve 0.2 uM demir zerrelerin bir bulamacı PA içine RV ile infüze edilir. Demir parçacıkları küçük boyutu nedeniyle, pulmoner kapiller yatak geçemez ve böylece küçük PA yatırılır. Akciğerler, şişirilmiş kaldırılır ve ayrışmış vardır. Demir içeren gemilerin bir mıknatıs kullanarak çözüm çıkardı vardır. Sonuçta, gemilerin bir doku kültürü çanak içine kapl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH HL109478 (KNF) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar izole ve kültür PASMC korunmasında kabul ve yardım için Gina Kim ve Joann Taylor teşekkür ederim.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
- Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
- Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
- Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
- Jobe, A. H., Bancalari, E. Bronchopulmonary dysplasia. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1723-1729 (2001).
- Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
- Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
- Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
- Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
- Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
- Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
- Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
- Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
- Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
- Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
- Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
- Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
- Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
- Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
- Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
- de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
- de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30 (2009).
- Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
- Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
- Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
- Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
- Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).
