인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리
Summary
이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.
Abstract
이 프로토콜에서 우리는 인간 흉선에서 수지상 세포 (DC) 및 상피 세포 (TEC)를 분리하는 방법을 제공한다. DC와 TEC의 주요 항원 제시 세포 정상 흉선에있는 (APC) 타입이며, 그것은 그들이 잘 흉선 선택시 뚜렷한 역할을한다는 것을 설정됩니다. 이 세포는 흉선에서 별개의 미세 환경에서 지역화 된 각 APC 유형은 세포의 단지 작은 인구를 구성하고 있습니다. 추가로 이들 세포 유형의 생물학을 이해하기 위해, 이러한 세포 집단의 특성은 매우 바람직하지만 인해 낮은 주파수로, 이러한 세포 유형의 임의의 분리는 효율적이고 재생 가능한 절차를 필요로한다. 이 프로토콜은 다양한 휴대 속성의 특성에 적합한 세포를 얻을 수있는 방법을 자세히 설명합니다. 흉선 조직을 기계적으로 파괴되어 소화 효소의 상이한 단계 후에, 생성 된 세포 현탁액을 퍼콜 밀도 원심 분리 단계를 사용하여 농축한다. 골수 DC (의 CD11c의 격리를위한 <SUP> +), 저밀도 분획 (LDF)의 세포가 자기 세포 분류하여 immunoselected됩니다. TEC 인구 (MTEC, CTEC)의 보충은 특정 세포 마커를 사용하여 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀을 통해 그 이후의 분리를 허용하는 저밀도 퍼콜 세포 분획에서 조혈 (CD45 안녕하세요) 세포의 파괴에 의해 달성된다. 고립 셀은 다른 다운 스트림 애플리케이션에 사용될 수있다.
Introduction
흉선은 T 세포의 발달이 발생하는 기관이다. 흉선은 여전히 이전 시대에 감지 할 수 있지만이 연속적으로 지방으로 대체되는 경우를 상대적 절대적 크기는 나이와 함께 감소한다. 면역 반응에 대한 중요성은 1960 년대 초 1에서 증명되었다.
T 세포 레퍼토리는 기능적 큰폭 자기 관용 T 세포 레퍼토리이 결과, T 세포의 개발에 생존 또는 사망 큐를 선택해 흉선 APC 다른 종류의 펩티드-MHC 복합체와 T 세포 수용체의 상호 작용을 통해 형성된다.
인간 흉선 세포의 약 98 %는 흉선 세포라고도 T 세포를 개발하고있다. 나머지 2 %는 TEC의 다양한 (대뇌 피질, 수질, 낭하), 골수 및 plasmacytoid DC (MDC, PDC), 대식 세포, B 세포, 성숙 재 순환 T 세포, 과립구 등 다양한 종류의 세포들로 구성 에프식 표현형 ibroblasts, 내피 세포와 매우 드문 상피 세포는 근육, 신경, 호흡기 상피 세포와 같은 다른 조직 (그림 1)에서 세포의 닮은. 이들 중, TEC와 DC는 정상 흉선에있는 주요 APC 유형입니다. 최근 몇 년 동안, 문화 및 분자 프로파일 링이 APC 유형의 정화는 점점 더 많은 관심을 얻고있다. 으로 인해 낮은 주파수로, 자세한 분석을 위해 이러한 종류의 세포 중 어느 격리, 효율적인 재현하고 비용 효율적인 절차가 필요합니다. 여기에 제시된 방법은 이전에 발표 된 연구 3,4에서 수정합니다.
다른 조직과 같이, 흉선 세포로부터 추출 효소 단일 세포 현탁액을 얻기 위하여, 세포 – 세포 및 세포 – 매트릭스 상호 작용 네트워크를 disaggregating함으로써 달성 될 수있다. 좋은 분리 효율, 세포 수율, 세포 생존과 세포의의 유지와 같은 특정 매개 변수가 있습니다결정적이며 urface 마커 이러한 희귀 세포 집단의 성공적인 분리를 위해 최적화 될 필요가있다.
이 프로토콜에서, DC 및 TEC의 부분 집합의 분리는 기계적 장애 및 소화 효소에 의해 조직의 단일 세포 현탁액을 만들기에 의해 수행된다. 우리는 조직을 함께 보유하고있는 고유 콜라겐을 분해하는 다른 효소 활성의 균형 잡힌 비율이 클로스 트리 디움 histolyticum에서 콜라게나 제를 사용합니다. DNA 분해 효소 I은 (흉선 세포는 매우 민감하다.) 우리는 또한 티슈 dissociator 의해 보조 기계 및 효소 조직 치료를 포함하는 전형적인 효소 조직 소화에 대안을 제공 인해 사균없는 DNA로 세포 응집을 감소시키기 위하여 효소 용액에 포함된다. 단일 세포 현탁액을 세포의 저밀도 분획 (LDF)의 농축을위한 단일 퍼콜 밀도 원심 분리된다. 세포의이 부분에서, DC는 F를 염색하여 분리 할 수있다또는 DC-표면 마커 (즉,의 CD11c의 +) 및 자기 분리 또는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여. 흉선 세포의 대부분을 구성하는 림프 세포와는 달리, TEC는 높은 수준의 CD45을 표현하지만, 상피 세포 접착 분자 EpCAM에 대한 긍정적하지 않습니다. CTEC는 CDR-2 (대뇌 피질 돌기 망상-2) 항체 4,5 다소 낮은 EpCAM 식으로 인식이 아직 정의되지 않은 항원의 발현에 의해 수질 TEC 구별 될 수있다. 차동 EpCAM 및 CDR2의 공동 발현은 고속 셀을 통해 이러한 TEC 서브 세트들의 효율적인 분리가 6을 정렬한다.
여기에 제시된 프로토콜은 인간의 흉선 조직에 최적화되어 있습니다. FACS 정렬이 사용되는 경우에 절차의 지속 기간은, 조직의 양과 실험자의 능력뿐만 아니라, 셀 소터의 속도에 따라 달라진다. 일반적으로 DC의 분리를위한 프로토콜은 5 이내에 완료 할 수 있습니다-6의 시간과 8 ~ 10 시간에 TEC의 격리를위한. 흉선 조직에서 DC와 TEC의 부분 집합의 격리는 시간에 민감한입니다. 빠른 분리 절차, 세포의 상태 나은. 마지막으로, 절연 세포 mRNA의 비교 연구 및 단백질 발현, PCR 실험, 단백질 분리, 분자량 프로파일 (즉 transcriptomics, 마이크로 RNA 분석)뿐만 아니라 세포 배양 6 같은 추가 조사를 위해 사용될 수있다.
윤리 정책
인간의 흉선 조직에서 작동 할 수 있도록하기 위해 연구원 조직은 일반적으로 미성년자에서 얻을 수 있기 때문에 로컬 윤리위원회 또는 담당 기관뿐만 아니라 기증자의 정보를 서면 동의 (또는 일반적으로 자신의 부모로부터 승인을 받아야합니다 어린이). 또한, 인간의 모든 조직은 잠재적으로 감염성 및 적절한 조치는 등, 장갑, 작업로,주의해야 것으로 취급되어야한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 Gotter 등 4 발행 프로토콜의 변형이다. 프로토콜의 중요한 단계는 상태와 조직의 초기 제제뿐만 아니라 퍼콜 밀도 분리이다. 우리는 최대한 빨리 수집 한 후 조직을 처리하는 것이 좋습니다. 그것은 청소 및 조직을 절단 할 때 빠르지 만 철저하게 작동하는 것이 중요합니다. 단계 2.3에 기재된 흉선 세포 세척 동안, 간질 세포를 손상시킬 수있는 너무 격렬?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 CDR2 항체를 제공하는 흉선 샘플 및 브루노 Kyewski (DKFZ, 하이델베르크, 독일)과 함께 우리를 제공하기위한 흉부 외과 부, 대학 병원 튀빙겐의 외과 의사에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 선별 시설 (튀빙겐 대학)에서 한스 – 요 르그 Bühring 사브리나 GRIMM에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 SFB 685과 Hertie 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| Fetal Bovine Serum-Gold | PAA | A15-151 | |
| Bovine Serum Albumin | PAA | K41-001 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, grade II bovine pancreatic | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit | Molecular Probes | A-10235 | |
| anti-human CDR2 (purified) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | labeled with Alexa Fluor 488 | |
| anti-human CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| anti-human EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-human CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| anti-CD45 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for tissue dissociator |
| Percoll (density 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells |
| 0.22 μm filter | Millex GS | SLGS033SS | Syringe driven |
| Stericup filter unit | Millipore | SCGPU05RE | Pump driven |
| 50 ml PC oak ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP conical tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml test tubes | Becton Dickinson | 352058 | FACS stainings |
| Cell strainer 70 μm | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | tissue dissociator |
References
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