Monitoring Veranderingen in Membrane Polariteit, Membraan Integriteit, en intracellulaire Ion concentraties in<em> Streptococcus pneumoniae</em> Het gebruik van fluorescente kleurstoffen

Summary

Unlike die gezien eukaryoten, er een gebrek aan studies die details membraan depolarisatie en ionenconcentratie veranderingen in bacteriën, vooral als hun kleine formaat maakt conventionele meetmethoden moeilijk. Hier hebben we detail protocollen voor toezicht op dergelijke gebeurtenissen in de grote Gram-positieve ziekteverwekker Streptococcus pneumoniae met behulp van fluorescentie technieken.

Abstract

Membraan depolarisatie en ionfluxen zijn gebeurtenissen die uitgebreid bestudeerd in biologische systemen vanwege hun vermogen om diepgaande impact cellulaire functies, waaronder energetica en signaaltransmissie. Hoewel fluorescentie-en elektrofysiologische werkwijzen, inclusief verbruik elektrode en patch-klemming, zijn goed ontwikkeld voor het meten van deze gebeurtenissen in eukaryotische cellen, methode voor het meten soortgelijke gebeurtenissen in microörganismen gebleken moeilijker te ontwikkelen gezien hun kleine grootte in combinatie met complexe buitenoppervlak bacteriën afscherming het membraan. Tijdens onze studies van de dood-initiatie in Streptococcus pneumoniae (pneumokok), wilden we de rol van het membraan gebeurtenissen, waaronder veranderingen in polariteit, integriteit, en intracellulaire ionenconcentraties helderen. Het zoeken van de literatuur, vonden we dat heel weinig studies bestaan. Andere onderzoekers hadden radio-isotoop opname of evenwicht te ion griep meten bewaaktxes en membraanpotentiaal en een beperkt aantal studies, vooral bij Gram-negatieve organismen, had enig succes gezien met behulp carbocyanine of oxonol fluorescente kleurstoffen aan membraanpotentiaal meten, of het laden van bacteriën met cel-permeant acetoxymethyl (AM) ester versies van ion-gevoelige fluorescente indicator kleurstoffen. We daarom vastgesteld en de geoptimaliseerde protocollen voor het meten van membraanpotentiaal, breuk, en ion-transport in de Gram-positieve organisme S. pneumoniae. We ontwikkelden protocollen met de bis-oxonolkleurstof DiBAC ₄ (3) en de mobiele impermeant kleurstof propidiumjodide membraan depolarisatie en scheuren te meten, respectievelijk, alsook werkwijzen optimaal laden pneumokokken met de AM esters van de kleurstoffen ratiometrische Fura-2, PBFI en BCECF veranderingen in intracellulaire concentratie van ^{Ca2 +,} K ⁺ en H ^+, respectievelijk detecteren, met fluorescentie-detectie plaatlezer. Deze protocollen zijn het eerste in hun soort voor de pneumokoken de meerderheid van deze kleurstoffen niet zijn gebruikt in een andere bacteriële species. Hoewel onze protocollen geoptimaliseerd voor S. pneumoniae, wij geloven dat deze aanpak moet een uitstekend uitgangspunt voor soortgelijke studies in andere bacteriesoorten vormen.

Introduction

Ons laboratorium heeft een eiwit-lipide complex van moedermelk genoemd GEHUCHT (voor humaan alfa-lactalbumine gemaakt dodelijk tumorcellen) die apoptose induceert in tumorcellen geïdentificeerd, maar kan ook een verscheidenheid van bacteriële species ^1,2 doden. De soorten die bleken bijzonder gevoelig te zijn die de luchtwegen richten, met Streptococcus pneumoniae (pneumokok de) tonen de grootste gevoeligheid en een apoptose-achtige fenotype dood ^2,3. Membraan depolarisatie en specifieke ionentransport gebeurtenissen zijn goed beschreven en cruciale gebeurtenissen gedurende geprogrammeerde celdood in eukaryote cellen, vooral in de mitochondriën, waar radioactieve TPP ⁺ ionen en fluorescente kleurstoffen zoals JC-1 en TMRE zijn gebruikt om depolarisatie van de mitochondriale membraan ³ tonen ^-5. Dus zochten we om meer te leren over het effect van gehucht op deze membraan-gerelateerde functies in de pneumokok als we onze inspanningen gericht opontwikkelen van een beter begrip van de mechanische componenten van de apoptose-achtig fenotype in bacteriën, met grote mogelijkheden voor het identificeren van nieuwe antibacteriële therapie of vaccinkandidaten in het proces.

Bij het ​​streven naar de vaststelling van protocols voor onze mechanistische studies, ontdekten we dat in tegenstelling tot de goed beschreven methodiek in eukaryote systemen, zijn er zeer weinig gepubliceerde studies detaillering elektrofysiologie en ionen transport mechanismen van de bacteriële membraan ^6,7. Dit wordt voornamelijk toegeschreven aan de kleinere omvang van micro-organismen en hun oppervlak architectuur, met name de aanwezigheid van celwand, dat beperkt de toegankelijkheid van het membraan voor gebruik van conventionele methoden zoals eukaryotische patchklemmen, hoewel sommige studies met grote protoplasten uitgevoerd met wisselend succes ^8,9. Naarmate het werk met deze gigantische protoplasten is niet een ideaal of zelfs praktische methode voor de meeste soorten bacteriën, omdat het de mens nodig heeftipulated bacteriën in een onnatuurlijke en abiotische toestand, de beperkte studies van bacteriële membraan polariteit die zijn uitgevoerd zijn voornamelijk werkzaam flowcytometrie en gebruik van cyanine en oxonol fluorescente kleurstoffen ^10-16.

In plaats van flowcytometrie, die individuele fluorescentie metingen verzamelt ve bacterie op een enkel tijdstip, kozen we een fluorescentiedetectie plaatlezer om fluorescentie-intensiteit van bacteriële suspensies detecteren in een 96-putjes tijd. Zo konden we een populatie van bacteriën op verschillende tijdstippen met veel grotere eenvoud en gemak, en continu de fluorescentie kinetiek van de gehele bevolking voor langere tijd, hetgeen moeilijk te bereiken met flowcytometrie. Na het testen van een grote verscheidenheid van potentiële gevoelige fluorescente kleurstoffen (waaronder de genoemde voor gebruik met de mitochondria), bereikten wij de beste technische en praktische succes met debis-oxonolkleurstof DiBAC genoemd ₄ (3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethineoxonol) veranderingen in polariteit controleren.

We vonden ook waardevol gelijktijdig verstoringen in de integriteit van het membraan te controleren met propidium jodide (PI). Deze kleurstof fluoresceert bij binding aan nucleïnezuur, maar is alleen in staat om dat te doen als de integriteit van de bacteriële membraan wordt aangetast, waardoor het de populaire component gebruikt om dode cellen te detecteren in levende-dode kleuring assays. Naast PI SYTOX groen en TO-PRO-1 fluorescerende kleurstoffen die qua actie en zijn eerder voor bacteriën in enkele studies met flowcytometrie detectiemethoden ^17. We kozen ervoor om PI te gebruiken vanwege de golflengte die ons toeliet om de fluorescentie monitoren gelijktijdig met DiBAC in een bepaald monster.

In onze studies hebben we GEHUCHT, alsmede andere verwante eiwit-lipide complex met bactericide activiteit waargenomenbekend als Eloa, geïnduceerde depolarisatie en breuk van het bacteriële membraan, zoals aangegeven door een toename in de fluorescentie van beide kleurstoffen bij behandeling van pneumokokken ^3,18,26. Voor beide complexen waargenomen dat de fluorescentie-intensiteit van DiBAC ₄ (3) verhoogd vóór de toename in intensiteit van PI, wat aangeeft dat depolarisatie zich vóór scheuren en is daarom een specifieke gebeurtenis veroorzaakt door onze bactericide eiwit-lipide-complexen van belang. Dit onderscheid is belangrijk te maken, als breuk van het membraan kan zelf leiden tot niet-specifieke depolarisatie. Meten en analyseren van zowel DiBAC ₄ (3) en PI fluorescentie kinetiek gelijktijdig konden we de relatie tussen de twee membraanlagen gebeurtenissen, wat een extra voordeel van fluorometrie plaats van doorstroomcytometrie onderzocht.

Om bacteriële ionenflux bewaken, is er een aantal eerdere succes met het gebruik van radio-isotopen, waaronder het meten van de opname van45 Ca ^{2 +} in de pneumokok ^19,20, die we ook hebben gebruikt in onze recente studies ^{18, 21.} Het werken met deze radioactieve ionen heeft een aantal nadelen. Ze kunnen duur, tijdrovend en rommelig, en kan ook het individu bloot uitvoeren van het experiment te schaden, afhankelijk van de isotoop van belang. Bovendien is het moeilijk om snelle veranderingen tijdig te signaleren. Zo hebben we gedraaid naar een andere manier van meten die acetoxymethyl (AM) ester versies van ionen-gevoelige fluorescente indicator kleurstoffen werken. Op zichzelf is de indicatorkleurstof opgeladen en niet gemakkelijk door het membraan, maar met de toevoeging van de lipofiele estergroep, kan nu ongeladen moleculen door het membraan van de bacterie. Bij binnenkomst in de inrichting, de bacteriële esterasen splitsen de estergroep, vrij blijft de kleurstof in de cel en opnieuw geladen, zijn vermogen om de cel te verlaten aanzienlijk vertragen en waardoor de kleurstof to ophopen in de tijd. Echter, het gebruik van deze kleurstoffen ester is slechts in enkele bacteriesoorten beschreven veranderingen in intracellulaire Ca ^{2 + 22-24} en H ^{+ 16} sporen met verschillende methoden laden, detectie, en succes.

Met een verlangen om veranderingen in intracellulaire Ca ^{2 +} monitoren en ook K ⁺ en H ⁺ niveaus in S. pneumoniae na behandeling met HAMLET en andere verbindingen, we succesvol aangemaakt protocollen om efficiënt te laden fluorescerende indicator kleurstoffen in bacteriële cellen. Effectieve laden in bacteriën vereist zowel probenecide dat kleurstofretentie stijgt met anion-transporteurs en PowerLoad, een eigen verbinding van Life Technologies dat laden efficiëntie verhoogt blokkeren. Fura-2/AM (detecteren van Ca ^{2 +),} PBFI / AM (detecteren van K ^+), en BCECF / AM (detecteren van H ⁺⁾ werden met succes in zowel niet-ingekapselde en ingekapselde pneumokokken st geladenregens waarmee meting van de resulterende fluorescentie patronen na toevoeging van ionoforen zoals ionomycine ^{(Ca2 +} ontkoppelaar), valinomycine (K ⁺ ontkoppelaar) en CCCP (H ⁺ ontkoppelaar) met fluorescentie detectie plaatlezer ^{18, 21.}

Protocol

1. Voorbereiden van bacterieculturen Groeiende kweek voor gebruik in proeven In een 37 ° C verwarmen blok, ontdooien van een bevroren voorraad-flesje van S. pneumoniae en zijn inhoud aan 9 ml verse, voorverwarmde Todd-Hewitt bouillon met 0,5% gistextract (THY) voor een totaal volume van 10 ml in een glazen kweekbuis. Incubeer statisch bij 37 ° C totdat de kweek mid-log fase (Abs ≈ 600 nm 0,5-0,6) bereikt. 2….

Representative Results

Voor alle experimenten, er is een monster en stel aanwezig in elk putje omstandigheden. Dus elke tracing vertegenwoordigt de fluorescentie intensiteit van een volledige populatie van bacteriën in de tijd. De resultaten moeten gemakkelijk interpreteerbaar zijn, met een duidelijk onderscheid tussen de fluorescentie van de behandelde monsters en de onbehandelde controles. De kinetiek en intensiteit van een waargenomen verandering in fluorescentie kan informaties mogelijk mechanisme en omvang van de gebeurtenis wo…

Discussion

Ondanks de beperking dat formaat weer voor elektrofysiologie behulp van klassieke methoden om veranderingen in de polariteit en integriteit van het membraan en veranderingen in ion concentraties in bacteriën te detecteren, hebben we een manier om deze gebeurtenissen S. meten beschreven pneumoniae met fluorescerende kleurstoffen. De protocollen zijn de eerste in hun soort beschreven voor de pneumococcus en een van de weinige beschreven bacteriële soorten in het algemeen. Met behulp van een fluorescent…

Materials

Todd Hewitt	Bacto, BD Diagnostics	249240
Yeast Extract	Bacto, BD Diagnostics	212750
Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)	Molecular Probes	B-438
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Make up in deionized water
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100X concentrate
Probenecid	Molecular Probes	P36400	Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	Special packaging (50 µg aliquots)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	Special packaging (50 µg aliquots)
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	monobasic
K2HPO4	JT Baker	4012-01	dibasic
NaOH	JT Baker	5565-01
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	Special packaging (50 µg aliquots)
CCCP	Sigma-Aldrich		Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,
			dissipating the electrical potential and the H+ gradient.
Culture tube	VWR	53283-802	Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass
Spectrophotometer	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml plastic conical tube	Corning	430790
Clear 96-well polystyrene microtiter plate	Fisher Scientific	12-565-501
Plate reader	BioTek	Synergy 2 Multi-Mode
		Microplate Reader
Gen5 software	BioTek	Gen5™ Software