ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב<em> Streptococcus pneumoniae</em> שימוש צבעי ניאון
Summary
שלא כמו שראה לאאוקריוטים, יש מיעוט מחקרים ששלילת קוטביות קרום פירוט וריכוז יונים שינויים בחיידקים, כגודלם הקטן בעיקר הופך את השיטות מקובלות של מדידה קשה. כאן, אנו פרוטוקולי פרט לניטור אירועים כאלה בפתוגן גראם חיובית המשמעותי Streptococcus pneumoniae תוך שימוש בטכניקות הקרינה.
Abstract
נתיבי שלילת קוטביות קרום ויון הם אירועים שנחקרו רב במערכות ביולוגיות בשל היכולת שלהם להשפיע עמוקות תפקודים תאיים, כולל האנרגטיקה וtransductions אות. בעוד שני שיטות הניאון ואלקטרו, ובכלל זה שימוש אלקטרודת ותיקון-clamping, פותחו גם למדידת אירועים אלה בתאי אוקריוטים, מתודולוגיה למדידת אירועים דומים במיקרואורגניזמים הוכיחו יותר מאתגר כדי לפתח בהתחשב בגודל הקטן שלהם בשילוב עם יותר מורכב משטח חיצוני של חיידקי מיגון הממברנה. במהלך הלימודים של מוות חניכה בStreptococcus pneumoniae (pneumococcus) שלנו, אנחנו רוצים להבהיר את התפקיד של אירועי קרום, לרבות שינויים בקוטביות, יושרה, וריכוזי יון תאיים. חיפוש בספרות, מצאנו כי מעט מאוד מחקרים קיימים. חוקרים אחרים היו במעקב ספיגת radioisotope או שיווי משקל כדי למדוד שפעת יוןXES וקרום פוטנציאלי ומספר מצומצם של מחקרים, רובם באורגניזמים גראם שליליים, שראו הצלחה מסוימת באמצעות carbocyanine או oxonol צבעי ניאון למדידת פוטנציאל ממברנה, או טעינת חיידקים עם acetoxymethyl תא permeant (AM) גרסאות אסתר של יון רגיש צבעי ניאון מחוון. לפיכך, אנו הוקמו ומותאמים פרוטוקולים למדידת פוטנציאל ממברנה, קרע, ויוני תחבורה באורגניזם גראם החיובי ס דלקת ריאות. פיתחנו פרוטוקולים באמצעות צבע bis-oxonol DiBAC 4 (3) ויודיד propidium לצבוע תאי impermeant למדוד שלילת קוטביות קרום וקרע, בהתאמה, כמו גם שיטות לטעינה אופטימלית pneumococci עם אסטרים AM של צבעי ratiometric פורע-2, PBFI, וBCECF כדי לזהות שינויים בריכוזי תוך תאיים של Ca 2 +, K +, ו-H +, בהתאמה, באמצעות קורא צלחת הקרינה איתור. פרוטוקולים אלה הם הראשונים מסוגם לpneumococcusורוב הצבעים האלה לא היה בשימוש בכל מיני חיידקים אחרים. למרות שהפרוטוקולים שלנו כבר מותאמים לס pneumoniae, אנו מאמינים גישות אלו צריכות להוות נקודת התחלה מצוינת למחקרים דומים במינים חיידקים אחרים.
Introduction
המעבדה שלנו זיהתה חלבון מורכב שומנים מחלב אדם בשם המלט (לאדם Alpha-lactalbumin Made קטלני לתאים סרטניים), שגורם לאפופטוזיס בתאים סרטניים, אבל הוא גם מסוגל להרוג מגוון רחב של מיני חיידקי 1,2. המינים שנמצאו להיות רגיש במיוחד היו אלה המכוונים את דרכי נשימה, עם Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) בו מוצגות הרגישות הגדולה ופנוטיפ כמו אפופטוזיס, מות 2,3. אירועי תחבורת שלילת קוטביות קרום ויון ספציפיים שתוארו היטב ואירועים מכריעים באפופטוזיס בתאי אוקריוטים, בפרט במיטוכונדריה, שבו יונים רדיואקטיביים TPP + וצבעי ניאון כולל JC-1 וTMRE היו בשימוש כדי להדגים שלילת קוטביות של קרום המיטוכונדריה 3 -5. לפיכך, אנו מבקשים ללמוד יותר על ההשפעה של המלט על תכונות הקשורות לממברנה אלה בpneumococcus כפי שאנו מתמקדים מאמצינולפתח הבנה טובה יותר של הרכיבים מכניסטית של פנוטיפ כמו אפופטוזיס, בחיידקים, עם פוטנציאל גדול לזיהוי טיפולי אנטיבקטריאלי רומן או מועמדי חיסון בתהליך.
במבקש להקים פרוטוקולים עבור המחקרים מכניסטית שלנו, גילו כי בניגוד למתודולוגיה שתוארה היטב במערכות אוקריוטים, יש מעט מאוד מחקרים שפורסמו מפרטים מנגנוני אלקטרופיזיולוגיה והובלת יונים של 6,7 קרום החיידק. זו מיוחסת בעיקר לגודל הקטן יותר של מיקרואורגניזמים ואדריכלות פני השטח שלהם, ובמיוחד את נוכחותו של דופן תא, המגבילה את הנגישות של הקרום לשימוש בשיטות אוקריוטים קונבנציונליות כמו הידוק תיקון, אם כי כמה מחקרים באמצעות protoplasts הענק בוצעו בהצלחה מעורבת 8,9. ככל שעבודה עם protoplasts הענק אלה היא לא שיטה אידיאלית או אפילו מעשית עבור רוב מיני חיידקים שכן היא דורשת גברחיידקי ipulated במצב לא טבעי ואביוטי, המחקרים מוגבלים של קוטביות קרום חיידק שכבר בוצעו היו בעיקר מועסקים cytometry זרימה והשימוש בצבעי ניאון cyanine וoxonol 10-16.
במקום cytometry זרימה, המרכזת את קריאות הקרינה בודדות מחיידק אחד בכל נקודת זמן אחת, בחרנו להשתמש בקורא צלחת גילוי הקרינה כדי לזהות עוצמת הקרינה של השעיות חיידקים בפורמט צלחת 96 היטב לאורך זמן. זה אפשר לנו לטיפול באוכלוסייה של חיידקים בנקודות זמן שונים בפשטות רבה יותר ולהקל, ולפקח באופן רציף קינטיקה הקרינה של האוכלוסייה כולה לפרקי זמן ארוכים, שקשה להשיג באמצעות cytometry זרימה. לאחר בדיקת מגוון רחב של הצבעים הפוטנציאליים רגישים ניאון (כוללים אלה שהוזכרו לעיל לשימוש עם מיטוכונדריה), השגנו ההצלחה הטכנית ומעשית הטובה ביותר באמצעותצבע bis-oxonol נקרא DiBAC 4 (3) (BIS-(oxonol חומצת 1,3-dibutylbarbituric) trimethine) כדי לעקוב אחר שינויים בקוטביות.
מצאנו גם את זה חשוב כדי לפקח במקביל לשיבושים ביושרה של הקרום באמצעות יודיד propidium (PI). צבע זה מאיר על כריכה לחומצות גרעין, אבל הוא רק מסוגל לעשות זאת כאשר על שלמות קרום החיידק נפגעת, מה שהופך את המרכיב הפופולרי המשמש לגילוי תאים מתים במבחנים מכתים חיים מתים. בנוסף לPI, Sytox ירוק וTO-PRO-1 צבעי ניאון שדומים בפעולה וכבר שימשו בעבר לחיידקים בכמה מחקרים באמצעות cytometry זרימת שיטות זיהוי 17. אנחנו בחרנו להשתמש PI עקב גל העירור שלה, שאיפשר לנו לעקוב אחר הקרינה שלה במקביל לDiBAC במדגם נתון.
במחקרים שלנו, יש לנו ציינו כי המלט, כמו גם אחר מורכבת חלבון שומנים בדם הקשורים לפעילות bactericidalהמכונה ELOA, שלילת קוטביות וקרע מושרה של קרום החיידק כפי שצוין על ידי עלייה בקרינה של שני הצבעים על הטיפול בpneumococci 3,18,26. עבור שני מתחמים, הבחין כי עוצמת הקרינה של DiBAC 4 (3) עלתה לפני העלייה בעוצמתו של צרכן, מצביע על כך ששלילת הקוטביות התרחשה לפני הקרע, והוא, אם כן, אירוע ספציפי הנגרם על ידי קומפלקסי חלבוני שומנים בדם bactericidal שלנו ריבית. הבחנה זו חשובה לעשות, כמו קרע של הקרום יכול לגרום לעצמו שלילת קוטביות לא ספציפית. קינטיקה (3) וקרינת PI מדידה וניתוח שני DiBAC 4 אפשרה במקביל לנו לבחון את הקשר הזה בין אירועי קרום שתיים, אשר מהווה יתרון נוסף של שימוש בfluorometry במקום cytometry זרימה.
כדי לעקוב אחר שטף יון חיידקים, יש כבר כמה הצלחה קודמת עם שימוש ברדיואיזוטופים, כולל מדידת ספיגה של45 Ca 2 + בpneumococcus 19,20, שיש לנו גם שימוש במחקרים האחרונים שלנו 18, 21. עם זאת, יש בעבודה עם יונים רדיואקטיביים אלה יש כמה חסרונות. הם יכולים להיות יקרים, גוזלים זמן, ומבולגן, והוא יכול גם לחשוף את פרט ביצוע הניסוי כדי לפגוע, תלוי באיזוטופ של עניין. בנוסף, קשה לעקוב אחר שינויים מהירים לאורך זמן. לפיכך, פנינו לכיוון שיטה חלופית של מדידה שמעסיקה גרסאות אסתר acetoxymethyl (PM) של צבעי ניאון מחוון יון רגיש. על ידי עצמו, צבע המחוון טעון ואינו עובר דרך הממברנה בקלות, אבל עם התוספת של קבוצת אסתר lipophilic, המולקולה כעת בלתי טעונים יכולה לעבור דרך הממברנה של החיידק. עם כניסתו לפנים, esterases החיידקים לדבוק קבוצת אסתר, והשאיר את צבען חופשי בתוך התא והואשם שוב, להאט באופן משמעותי את יכולתה לצאת מהתא ומאפשר לא לצבועo מצטברת בתוך לאורך זמן. עם זאת, שימוש בצבעי אסתר אלה תוארו רק בכמה מיני חיידקים כדי לזהות שינויים בתאיים Ca 2 + 22-24 ו-H +16, עם שיטות שונות של העמסה, איתור, והצלחה.
עם רצון לעקוב אחר שינויים בתאיים Ca 2 + וגם רמות K + ו-H + בס pneumoniae על טיפול עם המלט ותרכובות אחרות, יצרנו בהצלחה פרוטוקולים כדי לטעון צבעי ניאון מחוון ביעילות לתאי חיידקים. טעינה יעילה לחיידקים נדרשים שני פרובנציד שמגביר אצירת צבע על ידי חסימת אניון-מובילים וPowerLoad, מתחם קנייני מחיים טכנולוגיים שמגביר את יעילות טעינה. Fura-2/AM (גילוי Ca 2 +), PBFI / AM (גילוי K +), וBCECF / AM (גילוי + H) הועמסו בהצלחה לתוך st pneumococcal שני unencapsulated והמארזגשמים המאפשרים מדידה של דפוסי הקרינה וכתוצאה מכך לאחר תוספת של יונופורים, כגון ionomycin (Ca 2 + uncoupler), valinomycin (K + uncoupler) וCCCP (H + uncoupler) באמצעות צלחת גילוי הקרינה קורא 18, 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות המגבלה שהגודל מציג לשימוש בשיטות אלקטרופיזיולוגיה קלאסיות כדי לזהות שינויים בקוטביות ושלמותו של הקרום והשינויים בריכוזי יונים בתוך חיידקים, שתארנו דרך למדוד את האירועים הללו בס דלקת ריאות באמצעות צבעי ניאון. הפרוטוקולים שלנו הם הראשונים מסוגם תיארו לpneu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס (גרנט 53085), קרן JR Oishei, ואיגוד הריאות האמריקאי (גרנט RG-123,721-N) לAPH, וF31DC011218 מלגת NIH (NIDCD) לEAC.
Materials
| Todd Hewitt | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| Yeast Extract | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) | Invitrogen (GIBCO) | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) | Molecular Probes | B-438 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Make up in deionized water |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Molecular Probes | P10020 | 100X concentrate |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial |
| Fura-2/AM | Molecular Probes | F1221 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| PBFI/AM | Molecular Probes | P1267 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | monobasic |
| K2HPO4 | JT Baker | 4012-01 | dibasic |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| BCECF/AM | Molecular Probes | B1170 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| CCCP | Sigma-Aldrich | Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, | |
| dissipating the electrical potential and the H+ gradient. | |||
| Culture tube | VWR | 53283-802 | Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | Spectronic 20D+ | |
| 15 ml plastic conical tube | Corning | 430790 | |
| Clear 96-well polystyrene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Plate reader | BioTek | Synergy 2 Multi-Mode | |
| Microplate Reader | |||
| Gen5 software | BioTek | Gen5™ Software |
References
- Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
- Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).
- Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (Δψ m) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
- Dominguez, D. C. Calcium signalling in bacteria. Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).
- Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family. Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).
- Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. A patch-clamp study of Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).
- Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).
- Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).
- Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).
- Shapiro, H. M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods. 21 (3), 271-279 (2000).
- Shapiro, H. M. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).
- Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions. Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).
- Suzuki, H., Wang, Z. -. Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes. Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).
- Breeuwer, P., Abee, T. Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques. Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).
- Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).
- Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death. J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).
- Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential. J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).
- Trombe, M. C. Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence. J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).
- Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Futsaether, C. M., Johnsson, A. Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes. Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).
- Tisa, L. S., Adler, J. Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content. J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).
- Werthen, M., Lundgren, T. Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens. J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).
- Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).
- Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against. PLoS One. . 8, (2013).
