Мониторинг изменения мембранного полярность, мембраны целостности и внутриклеточных концентрации ионов в<em> Пневмококк</em> Использование флуоресцентных красителей

Summary

В отличие от, что видели для эукариотов, существует нехватка исследований, которые подробно деполяризации мембраны и концентрации ионов изменения в бактериях, в первую очередь, как их небольшого размера делает традиционные методы измерения трудной. Здесь мы подробно протоколы для мониторинга таких событий в значительной грамположительных патогенов пневмококк использованием методов флуоресценции.

Abstract

Деполяризации мембраны и ионные потоки события, которые были тщательно изучены в биологических системах в связи с их способностью глубоко повлиять клеточные функции, в том числе энергетики и сигнальных каскадов. Хотя оба люминесцентные и электрофизиологические методы, в том числе использования электрода и патч-зажим, были хорошо разработаны для измерения этих событий в эукариотических клетках, методология для измерения подобных событий в микроорганизмов оказались более сложным развивать учитывая их небольшой размер в сочетании с более сложным Наружная поверхность бактерий защитные мембраны. Во время наших исследований смертном посвящения в пневмококк (пневмококк), мы хотели выяснить роль мембранных событий, в том числе изменений в полярности, целостность и внутриклеточной концентрации ионов. Поиск литературу, мы обнаружили, что существует очень мало исследований. Другие исследователи проводили мониторинг поглощение радиоизотопный или равновесия для измерения ионного гриппРЭС и мембранный потенциал и ограниченное число исследований, в основном в грамотрицательных микроорганизмов, видел некоторый успех с помощью карбоцианиновых или oxonol флуоресцентных красителей для измерения мембранного потенциала, или загрузки бактерии с мобильного проникающий ацетоксиметил (AM) эфирные версии ионно-чувствительный флуоресцентные красители индикатор. Поэтому мы созданы и оптимизированы протоколы для измерения мембранного потенциала, разрыв, и ионно-транспорт в грамположительных организма С. пневмонии. Мы разработали протоколы с использованием бис-oxonol краситель DiBAC ₄ (3) и йодид пропидия краситель клеток-impermeant измерить деполяризацию мембраны и разрыв, соответственно, а также методы, чтобы оптимально загрузить пневмококков с АМ сложных эфиров логометрических красителей Фура-2, PBFI и BCECF для обнаружения изменений в внутриклеточной концентрации Са ^{2 +,} K ^+, и H ^+, соответственно, с использованием флуоресценции обнаружения планшетов. Эти протоколы являются первыми в своем роде для пневмококкаи большинство из этих красителей не были использованы в любых других видов бактерий. Хотя наши протоколы были оптимизированы для S. пневмонии, мы считаем, что эти подходы должны стать отличной отправной точкой для аналогичных исследований в других видов бактерий.

Introduction

Наша лаборатория выявила комплекс белок-липидных от молоке имени Гамлет (для человека Альфа-лактальбумин Сделано смертельным для опухолевых клеток), который индуцирует апоптоз в опухолевых клетках, но также способен убить множество видов бактерий ^1,2. Виды, которые были найдены, чтобы быть особенно чувствительны были те, которые нацелены на дыхательные пути, с пневмококк (пневмококк) отображения наибольшей чувствительностью и апоптоз, как фенотип смерти ^2,3. Деполяризацию мембраны и конкретных ионов транспортных события хорошо описаны и важные события во время апоптоза в клетках эукариот, особенно в митохондрии, где радиоактивные ТЭС ⁺ ионы и флуоресцентные красители, включая JC-1 и TMRE были использованы для демонстрации деполяризацию мембраны митохондрий ^{3 -5.} Таким образом, мы стремились узнать больше о влиянии деревушке на этих мембранных функций, связанных в пневмококка, как мы сосредоточили свои усилия наразвить лучшее понимание механических компонентов апоптоз-фенотип у бактерий, с большим потенциалом для выявления новых антибактериальные терапии или вакцин-кандидатов в процессе.

Стремясь установить протоколы для наших механистических исследований, мы обнаружили, что в отличие от хорошо описанной методологии в эукариотических системах, существует очень мало опубликованных исследований подробно электрофизиологии и переноса ионов механизмы бактериальной мембраны ^6,7. Это в первую очередь связано с меньшим размером микроорганизмов и их поверхностной архитектуры, в частности наличие клеточной стенки, которая ограничивает доступ мембраны для использования обычных методов, таких как эукариотические фиксации потенциала, хотя некоторые исследования с использованием гигантских протопластов были выполнены с переменным успехом ^8,9. Как работа с этими гигантскими протопластов не является идеальным или даже практический метод для большинства видов бактерий, так как требует мужчинуipulated бактерии в неестественном и неживой государства, ограниченные исследования бактериальной мембраны полярности, которые были выполнены уже в основном используется проточной цитометрии и использование цианиновых и oxonol флуоресцентных красителей ^10-16.

Вместо проточной цитометрии, который собирает отдельные измерения флуоресценции от одной бактерии в одной точке времени, мы решили использовать планшет-ридера обнаружение флуоресценции для обнаружения интенсивности флуоресценции бактериальных суспензий в формате 96-луночного планшета с течением времени. Это дало нам возможность лечить население бактерий в различные моменты времени с гораздо большей простотой и легкостью, а также постоянно наблюдать кинетики флуоресценции всего населения в течение длительных периодов времени, которые трудно достичь с помощью проточной цитометрии. После тестирования широкий спектр потенциальных чувствительных флуоресцентных красителей (в том числе те, которые упомянуты выше, для применения с митохондриями), мы добились оптимального технического и практического успеха, используябис-oxonol краситель называется DiBAC ₄ (3) (бис-(1,3-dibutylbarbituric кислота) trimethine oxonol) для мониторинга изменений в полярности.

Мы также обнаружили, что ценно для одновременно контролировать нарушения в целостности мембраны с помощью пропидий йодида (PI). Этот краситель флуоресцирует при связывании с нуклеиновой кислотой, но только в состоянии сделать это, когда целостность бактериальной мембраны находится под угрозой, что делает его популярным компонентом, используемым для обнаружения мертвых клеток в живых-мертвых окрашивания анализов. В дополнение к PI, Sytox зеленый и ТО-PRO-1 являются флуоресцентные красители, которые похожи в действии и были ранее использованы для бактерий через несколько исследований с использованием проточной цитометрии методов обнаружения ^17. Мы решили использовать PI из-за его длины волны возбуждения, что позволило нам контролировать его флуоресценции одновременно с DiBAC в данном образце.

В наших исследованиях мы наблюдали, что Гамлет, а также еще один белок, связанный с содержанием липидов комплекс с бактерицидной активностиизвестный как ELOA, индуцированной деполяризации и разрыв бактериальной мембраны, как показано увеличение флуоресценции обоих красителей при лечении пневмококков ^3,18,26. Для обоих комплексов, мы обнаружили, что интенсивность флуоресценции DiBAC ₄ (3) увеличилось до увеличению интенсивности PI, указывая, что деполяризация имели место до разрыва и, следовательно, определенное событие, индуцированный наших бактерицидных белок-липидных комплексов интерес. Это различие важно, чтобы сделать, как разрыв мембраны может сам вызвать неспецифическую деполяризацию. Измерение и анализ как DiBAC ₄ (3) и П. И. кинетики флуоресценции одновременно позволило нам изучить эту связь между двумя мембранных событий, что является дополнительным преимуществом использования флуорометрии вместо проточной цитометрии.

Для контроля потока бактериальный ионный, произошло некоторое предыдущий успех с помощью радиоизотопов, в том числе измерения поглощения45 Ca ^{2 +} в пневмококка ^19,20, который мы также использовали в наших последних исследований ^{18, 21.} Однако, работая с этими радиоактивных ионов имеет несколько недостатков. Они могут быть дорогими, много времени, и грязный, а также может подвергать человека проведении эксперимента вредить, в зависимости от изотопа интерес. Кроме того, трудно контролировать быстрые изменения во времени. Таким образом, мы обратились к альтернативным методом измерения, которая использует ацетоксиметиловый (AM) эфирные версии ионных чувствительных красителей флуоресцентного индикатора. Сам по себе индикаторный краситель заряжен и не проходит через мембрану легко, но с добавлением липофильного сложноэфирной группы, теперь незаряженные молекулы могут проходить через мембрану бактерии. Войдя внутрь, бактериальные эстеразы расщеплять эфирную группу, оставляя краску бесплатно внутри клетки и платить еще раз, значительно замедляя его способность выйти из клетки и позволяя краситель то накапливаться внутри в течение долгого времени. Тем не менее, использование этих красителей эфирных только было описано в нескольких видов бактерий для обнаружения изменений в внутриклеточного Са ^{2 + 22-24} и H ^{+ 16,} с разной методов погрузки, обнаружения, и успеха.

С желанием контролировать изменения внутриклеточного Ca ^{2 +,} а также уровни К ⁺ и Н ⁺ в S. пневмонии при обработке Гамлет и других соединений, мы успешно создали протоколы для эффективной загрузки флуоресцентные красители индикатор в бактериальные клетки. Эффективная загрузка в бактерии, необходимых как пробенецид, который увеличивает задержку красителя, блокируя анион-перевозчиков и энергосети, фирменная соединения из Life Technologies, которая увеличивает эффективность загрузки. Fura-2/AM (обнаружения Са ^{2 +),} PBFI / AM (обнаружения K ^+), и BCECF / AM (обнаружения H ⁺⁾ были успешно загружены в оба неинкапсулированного и инкапсулированном пневмококковой улдожди, позволяющие измерять полученных моделей флуоресценции после добавления ионофоров, таких как иономицином (Са ^{2 +} разобщающим), валиномицина (K ⁺ разобщитель) и CCCP (H ⁺ разобщающим) с использованием планшет обнаружения флуоресценции читателя ^{18, 21.}

Protocol

1. Подготовка бактериальных культур Выращивание культуры для использования в экспериментах В 37 ° C нагревательный блок, оттепель замороженный Stock-пузырек S. пневмонии и добавить его содержание до 9 мл свежей, предварительно нагретой Тодд-Hewitt бульон с 0,5% дрожжево?…

Representative Results

Для всех экспериментов, есть один образец и набор условий, присутствующих в каждую лунку. Таким образом, каждый отслеживания представляет собой интенсивность флуоресценции всей популяции бактерий с течением времени. Результаты должны быть легко интерпретировать, с четкого разгр…

Discussion

Несмотря на ограничения, что размер представляет для использования классических методов электрофизиологии для обнаружения изменений в полярности и целостности мембраны и изменений в ионных концентраций в бактерии, мы описали способ измерить эти события в S. пневмонии с помощью ?…

Materials

Todd Hewitt	Bacto, BD Diagnostics	249240
Yeast Extract	Bacto, BD Diagnostics	212750
Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)	Molecular Probes	B-438
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Make up in deionized water
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100X concentrate
Probenecid	Molecular Probes	P36400	Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	Special packaging (50 µg aliquots)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	Special packaging (50 µg aliquots)
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	monobasic
K2HPO4	JT Baker	4012-01	dibasic
NaOH	JT Baker	5565-01
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	Special packaging (50 µg aliquots)
CCCP	Sigma-Aldrich		Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,
			dissipating the electrical potential and the H+ gradient.
Culture tube	VWR	53283-802	Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass
Spectrophotometer	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml plastic conical tube	Corning	430790
Clear 96-well polystyrene microtiter plate	Fisher Scientific	12-565-501
Plate reader	BioTek	Synergy 2 Multi-Mode
		Microplate Reader
Gen5 software	BioTek	Gen5™ Software