In vivo twee-foton microscopie van de Single zenuwuiteinden in de huid
Summary
Het protocol voor dynamische longitudinale beeldvorming en selectieve laser laesie van zenuwuiteinden in reporter transgene muizen wordt gepresenteerd.
Abstract
Zenuwuiteinden in de huid zijn betrokken bij fysiologische processen zoals sensing 1 als in pathologische processen zoals neuropathische pijn 2. Hun dicht-bij-oppervlak positionering vergemakkelijkt microscopische beeldvorming van de huid zenuwuiteinden in levende intacte dier. Met multifoton microscopie, is het mogelijk om fijne beelden overwinnen het probleem van sterke lichtverstrooiing van het huidweefsel te verkrijgen. Reporter transgene muizen die EYFP expressie onder de controle van Thy-1 promoter in neuronen (inclusief omtrek sensorische neuronen) zijn zeer geschikt voor de longitudinale studies van afzonderlijke zenuwuiteinden gedurende langere tijd tot enkele maanden of zelfs levenslang. Bovendien, met dezelfde femtoseconde laser als voor de beeldvorming, is het mogelijk een selectieve laesies van zenuwvezels te produceren voor de studies van de herstructurering zenuwvezel. Hier presenteren we een eenvoudige en betrouwbare protocol lengterichting multifoton in vivo beeldvorming enlaser gebaseerde microchirurgie op de huid van muizen zenuwuiteinden.
Introduction
Cutane zenuwuiteinden ondergaan dynamische veranderingen onder verschillende pathofysiologische toestanden. Zenuwvezels kan gaan door het proces van degeneratie en regeneratie of herstructurering in de loop van ziektes zoals perifere neuropathie 2 of Morton's neuroom 3. Na traumatisch letsel, een belangrijk onderdeel van zenuwuiteinden dynamiek huid reinnervation van het beschadigde gebied. Echter, de gemeenschappelijke aanpak voor het onderzoek van de zenuwuiteinden is ex vivo histologische coupes die real-time informatie over de lopende processen 4 ontbreekt. Gebruik van genetisch gecodeerde fluorescente markers, is het mogelijk om de zenuwuiteinden te volgen in de huid van levende dieren, waardoor rijke en significant meer relevante informatie over de structurele veranderingen verkrijgen. Het onderzoek van cutane zenuwuiteinden kan via conventionele fluorescentiemicroscopie echter sterke lichtverstrooiing van het huidweefsel sterk ondermijnd de kwaliteitvan de verkregen gegevens 5. Multifoton microscopie maakt acquisitie van beelden met hoge resolutie in de sterk verstrooiende weefsel als gevolg van de niet-lineaire som van de energie van fotonen excitatie resulteert in emissie van fluorescentie alleen het brandpunt van het objectief. Dit effect leidt tot een sterke toename van de penetratiediepte en de verbetering van de signaal-ruisverhouding van de meting huidweefsels 6. Met dezelfde laser als voor beeldvorming, is het mogelijk om selectieve ontleding van de zenuwvezels 7 produceren. In het volgende protocol tonen we de werkwijze longitudinale beeldvorming van cutane zenuwuiteinden in vivo in reporter transgene muizen gecombineerd met selectieve laser laesie in de handel verkrijgbare multifoton microscoop systeem.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze video protocol tonen we de werkwijze voor niet-invasieve longitudinale twee-foton beeldvorming van enkele zenuwuiteinden.
De dynamiek van de huid innervaties wordt beïnvloed in dergelijke ziekten als psoriasis en perifere neuropathie 2, en in traumatische verwondingen 9. Twee-foton beeldvorming maakt een gedetailleerde analyse van de zenuwvezels structuren in collageen matrix. Het gebruik van transgene reporter muizen helpt om de problemen met de kleuring van d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Neurotar Ltd bedanken voor technische bijstand, CIMO Foundation en FGSN voor financiële steun.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
References
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
- Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
- Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
- Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
- Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
- Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
- Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).
