In Vivo microscopia a due fotoni di Endings singolo nervo in pelle
Summary
Il protocollo per l'imaging longitudinale dinamico e selettivo lesione laser di terminazioni nervose in topi transgenici giornalista è presentato.
Abstract
Terminazioni nervose in pelle sono coinvolti in processi fisiologici quali sensing 1 e nei processi patologici come il dolore neuropatico 2. Il loro posizionamento close-superficie facilita l'imaging microscopico delle terminazioni nervose della pelle nel vivere intatta di un animale. Utilizzando la microscopia multiphoton, è possibile ottenere immagini belle superando il problema della forte dispersione della luce del tessuto cutaneo. Reporter topi transgenici che esprimono EYFP sotto il controllo di Thy-1 promoter nei neuroni (compresi periferia neuroni sensoriali) sono adatti per gli studi longitudinali delle singole terminazioni nervose più lunghi periodi di tempo fino a diversi mesi o addirittura per tutta la vita. Inoltre, utilizzando lo stesso laser a femtosecondi come per imaging, è possibile produrre lesioni altamente selettivi di fibre nervose per gli studi della ristrutturazione fibre nervose. Qui, vi presentiamo un protocollo semplice e affidabile per multiphoton longitudinale imaging in vivo emicrochirurgia laser-based sul topo terminazioni nervose della pelle.
Introduction
Terminazioni nervose cutanee subiscono cambiamenti dinamici sotto diversi stati fisiopatologici. Le fibre nervose possono passare attraverso il processo di degenerazione e di rigenerazione o di ristrutturazione nel corso di tali malattie come neuropatia periferica 2 o Morton neuroma 3. Dopo la lesione traumatica, una parte importante di terminazioni nervose dinamiche in pelle è reinnervazione della zona danneggiata. Tuttavia, l'approccio comune per le indagini di terminazioni nervose sia ex vivo istologica di sezionamento che non dispone di informazioni in tempo reale sui processi in corso 4. Utilizzo di marcatori fluorescenti geneticamente codificati, è possibile tracciare le terminazioni nervose nella pelle degli animali vivi, ottenendo così ricco di informazioni e significativamente più rilevante sui cambiamenti strutturali. L'indagine di terminazioni nervose cutanee è possibile utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale, tuttavia, la forte dispersione della luce del tessuto cutaneo mina fortemente la qualitàdei dati acquisiti 5. Microscopia Multiphoton permette l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione nei tessuti fortemente dispersione dovuta alla sommatoria non lineare di energia di eccitazione fotoni di luce con conseguente emissione di fluorescenza solo dal punto focale dell'obiettivo. Questo effetto porta ad un forte aumento della profondità di penetrazione e il miglioramento di rapporto segnale-rumore per la misura nei tessuti cutanei 6. Utilizzando lo stesso laser per l'imaging, è possibile produrre dissezione selettiva delle fibre nervose 7. Nel seguente protocollo mostriamo il metodo dell'imaging longitudinale di terminazioni nervose cutanee in vivo in topi transgenici giornalista combinato con lesione selettiva laser con sistema disponibile in commercio microscopio multiphoton.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo video dimostriamo il metodo per non invasiva longitudinale a due fotoni di imaging di terminazioni nervose singoli.
La dinamica delle innervazioni pelle è influenzata in tali malattie come la psoriasi e la neuropatia periferica 2, e in lesioni traumatiche 9. L'imaging a due fotoni permette un'analisi dettagliata delle strutture fibre nervose in matrice di collagene. L'uso di topi transgenici transgenici permette di evitare i problemi di…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Neurotar Ltd. per l'assistenza tecnica, CIMO Fondazione e FGSN per il sostegno finanziario.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
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