הפוך מערכת דו היברידית שמרים לזהות יונקים הגרעיני קולטן שאריות כי אינטראקציה עם ligands ו / או יריבים
Summary
Ketoconazole נקשר ולעוינות pregnane X קולטן הפעלה (PXR). מסכי תפוקת שמרים גבוהים של מוטציות PXR להגדיר אזור ייחודי לketoconazole מחייב. שיטה גנטית המבוסס על שמרים זה מגלה אינטראקציות רצפטור הגרעיני רומן עם ligands שמקשר עם אתרי פני השטח מחייבים.
Abstract
כרגולטור קריטי של חילוף חומרים בסמים ודלקת, pregnane X קולטן (PXR), ממלא תפקיד חשוב בפתופיזיולוגיה מחלה המקשר את חילוף החומרים ודלקת (למשל steatosis כבד) 1,2. חל התקדמות רבה בזיהוי של ligands אגוניסט לPXR, לעומת זאת, יש תיאורים מוגבלים של יריבים כמו סמים ואתרי הקישור שלהם על PXR 3,4,5. מכשול קריטי היה חוסר היכולת לטהר את יעילות החלבון באורך מלא ללימודים מבניים עם יריבים למרות שPXR שוכפל ומאופיין ב1998. המעבדה שלנו שפותחה על שמרי תפוקה גבוהה רומן מבוסס assay שני ההיברידי להגדיר אנטגוניסט, ketoconazole של, מחייב שאריות על PXR 6. השיטה שלנו כרוכה ביצירת ספריות מוטאציות שתצלנה את ההשפעה של מוטציות בודדות על פני השטח AF-2 של PXR הצפוי לקיים אינטראקציה עם ketoconazole. הצלה או "רווח של הפונקציה" הערוץמוטציות nd יכולים להתבצע כך שמסקנות לגבי האינטראקציה הגנטית של ketoconazole ושאריות המשטח (ים) בPXR הן ריאלי. לכן, פיתחנו תפוקה גבוהה של שני היברידי שמרי מסך של מוטציות PXR אינטראקציה עם coactivator, SRC-1. שימוש בגישה זו, שבה את השמרים שונה כדי להתאים את המחקר של התרופה נגד פטריות, ketoconazole, אנחנו יכולים להפגין מוטציות ספציפיות על PXR מועשרת בשיבוטים מסוגלים להיקשר ketoconazole. לפי היגיון הפוך, אנו מגיעים למסקנה שהשאריות המקוריות הן שאריות אינטראקציה ישירות עם ketoconazole. assay זה מייצג רומן, assay הגנטי הצייתן למסך לאתרי קישור אנטגוניסט על משטחי קולטן גרעיני. assay זה יכול להיות מיושם על כל תרופה ללא קשר לפוטנציאל ציטוטוקסיות שלה לשמרים, כמו גם לחלבון תאי (ים) שלא ניתן ללמוד באמצעות ביולוגיה מבנית סטנדרטית או שיטות proteomic מבוססות. החסרונות פוטנציאליים כוללים פרשנות של נתונים (שיטות משלימות שימושי), רליאהה בשיטה אחת Y2H, מומחיות בטיפול בשמרים או ביצוע מבחני שני היברידי שמרים, וassay אופטימיזציה.
Introduction
Assay השמרים שני ההיברידי (Y2H) נעשה שימוש נרחב כדי לגלות אינטראקציות בין חלבונים ולאחרונה לגילוי של מולקולות קטנות, רומן המשבשות קומפלקסי חלבונים אינטראקציה 7, 8, 9, 10, 11. עם זאת, הגישות קונבנציונליות של assay זה, המשמש לגילוי סמים או "להיטים", אינן מאפשרות זיהוי של שאריות allosteric אינטראקציה של תרכובות כימיקלים בתוך משטחי חלבונים, שכאשר שינו עדיין אינטראקציה ולאפשר לחקירה של השאריות שינו 11 . ואכן, שיטה (ים) כזה, אם אפשרי לפתח, תאפשר מערכת שמרים צייתנית להערכת תפוקה גבוהה של שאריות האינטראקציה allosteric קריטיות לשיבוש אינטראקציה בין חלבונים. בהקשר של גילוי תרופות, הדרך הישירה ביותר להקים אינטראקציה של תרכובות עם חלבונים תהיה כרוכה בקביעה מבנית (למשל התגבשות של קומפלקס חלבון מעכב). שיטות אלה הן בהצטיינותbersome, להשתמש במשאבים משוכללים וזה לא אפשרי מבחינה טכנית לבצע מחקרים מבניים על כל חלבון.
מערכות הקרנת סמים גנטיות צייתניות הוקמו בחיידקים 1, 2 ומערכות מודל אחרות כמו שתי ההיברידי של יונקים. עם זאת, מערכות אלו זקוקות לאופטימיזציה ומערכות חלופיות כמו Y2H עדיין נבדקו ביותר בגילוי תרופות. ישנן מגבלות הכוללות רגישות ואמינות של אינטראקציות בשימוש בשיטות ייחודיות 13 עניים, לעומת זאת, assay Y2H אחד יכול להיות שונה כדי לענות על שאלות ספציפיות בנוגע לשאריות אינטראקציה. בתחום מחקר קולטן גרעיני, Y2H נעשה שימוש כדי להגדיר את חלבוני אינטראקציה 14, לעומת זאת, אינטראקציות חלבון אלה רק לעתים נדירות נעשו שימוש כדי להגדיר את האופי שבו ligands / יריבים אינטראקציה עם מתחמי קולטן חלבונים גרעיניים. לפיכך, המעבדה שלנו התמקדה מאמצים בהגדרת שיטה, במיוחד לחלבוני הקולטן שאינםנוח בקלות לproteomic שיטות מבוססות, שיחשוף ליגנד רומן / אנטגוניסט אינטראקציה שאריות באמצעות פלטפורמת גילוי Y2H מבוססת הפוכה.
בהתבסס על הממצא הקודם שלנו שketoconazole משבש PXR וactivator SRC-1, פיתחנו רומן הפוך מערכת Y2H שיאפשר לנו להגדיר ולחקור את שאריות ketoconazole האינטראקציה בPXR 6. השיטה שלנו מבוססת על המאפיינים של חלבון GAL4 שמרים שמורכבת מתחומים להפרדה אחראים להפעלת ה-DNA מחייבת ותעתיק. חלבון PXR LBD מבוטא היתוך לתחום LexA-DNA מחייב (DNA-BD), תוך שיתוף מפעילי אורך המלא SRC-1 (coactivator קולטן סטרואידים 1) חלבונים באים לידי ביטוי כהתכה לתחום הפעלת GAL4 (AD ). אינטראקציה בין PXR וחלבונים היתוך SRC-1 מובילה להפעלת תעתיק של אתרי GAL4 מחייבים המכילים גן כתב β-Lac Z המשתלב בשמרים genomדואר. Ketoconazole, אנטגוניסט PXR, משבש PXR ואינטראקציה SRC-1 15, 16, 17 ואנחנו יכולים לזהות את האינטראקציה של PXR וSRC-1 בנוכחותו או היעדריו של ketoconazole לאחר צביעת מושבות במסננים לפעילות X-gal. עיקרון Y2H מודגם באיור 1 והליך הניסוי מסוכם באיור 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב assay Y2H שונה שלנו, זיהינו שאריות חשובות לאינטראקציות ketoconazole על PXR 6. מאז SRC-1 הוא coactivator (ושובט לתוך וקטור pGADNot), אנחנו גם בדקנו האם SRC-1 יכול להפעיל ביטוי lacZ כאשר משובט למערכת הווקטור הפשה והאם זה הייתי משנה את פרופיל ההפעלה ו / או להשפיע על הדליפות של assay שני היברידי ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקי CA127231 ופרס דיימון רניון קרן החוקר קליני (CI 1502) (לSM). ברצוננו להודות לפרופסור זדנק דבוז'ק מPalacky אוניברסיטת אולומוץ, צ'כיה לתובנה מועילות שלו לדיון בניידות של טכניקה זו למוסד וסטנדרטיזציה של פרוטוקול שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Strain CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | Our lab | CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 . | |
| YPD Growth Medium | BD Biosciences | 630409 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate | BD Biosciences | 233520 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture | MP Biomedicals | 4250-412 | |
| ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranoside). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Luria Broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
| Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml) | Life Technology | 156-017 | |
| Ampicillin | Acros Organics | 61177 | |
| Ketoconazole | Sigma-Aldrich | K1003 | |
| N,N-Dimethylformamide | Acros Organics | 326871000 | |
| Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| 50% PEG-3350 solution, filter-sterilized | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Nitrocellulose Membrane | Whatman | 10402091 | |
| 10 cm Petri Dish | Fisher | 875712 | |
| 5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3' | our lab | PXR LBD forward primer for pSH2-1 | |
| 5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3' | our lab | PXR LBD reverse primer for pSH2-1 | |
| 5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3' | our lab | SRC-1 forward primer for pGADNOT | |
| 5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3' | our lab | SRC-1 reverse primer for pGADNOT | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| BamHI | our lab | R0136 | |
| SalI | our lab | R0138 | |
| NotI | our lab | R0189 |
References
- Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
- Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).
- Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. Elucidating the ‘Jekyll and Hyde’ Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists. Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).
- Pondugula, S. R., Mani, S. Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response. Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).
- Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. PXR antagonists and implications for drug metabolism. Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).
- Li, H., et al. Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR. J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).
- Hollenberg, S. M., et al. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).
- Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 74 (1), 205-214 (1993).
- Wang, H., et al. The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor. Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).
- Kalpana, G. V., Goff, S. P. Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).
- Hamdi, A., Colas, P. Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery. TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).
- Battesti, A., Bouveret, E. The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli. Methods. 58 (4), 325-334 (2012).
- Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems. Methods. 58 (4), 317-324 (2012).
- Albers, M., et al. Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins. Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).
- Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics. J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).
- Huang, H., et al. Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole. Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).
- Wang, H., et al. Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs. Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).
- Ghannoum, M. A., Rice, L. B. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).
- Kaur, R., Bachhawat, A. K. The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology. 145, 809-818 (1999).
- White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).
- Serebriiskii, I. G., et al. Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets. Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).
- Yang, L., et al. Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer. Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).
- Zhan, Y. Y., et al. The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK. Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).
