Reverter levedura Sistema de dois híbridos para identificar mamíferos Receptor Nuclear Resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas

Summary

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Abstract

Como um regulador fundamental no metabolismo de drogas e inflamação, Pregnane X Receptor (PXR), desempenha um papel importante na patofisiologia da doença ligando metabolismo e inflamação (por exemplo, a esteatose hepática) ^1,2. Tem havido muito progresso na identificação de ligantes agonistas para PXR, no entanto, há descrições limitadas de antagonistas droga-como e seus sítios de ligação PXR ^3,4,5. Uma barreira crítica tem sido a incapacidade de purificar de forma eficiente a proteína de comprimento completo para estudos estruturais com antagonistas, apesar do facto de PXR foi clonado e caracterizado em 1998. O nosso laboratório desenvolveu uma nova levedura de alto rendimento com base ensaio de dois híbridos para definir um antagonista, de cetoconazol, os resíduos de ligação em PXR ^6. O nosso método envolve a criação de bibliotecas de mutações que seriam resgatar o efeito das mutações individuais em FA-2 superfície de PXR o esperado para interagir com cetoconazol. Resgate ou "ganho de função" secomutações nd pode ser feita de tal forma que conclusões a respeito da interação genética de cetoconazol e do resíduo (s) de superfície em PXR são viáveis. Assim, foi desenvolvido um alto rendimento de dois híbridos tela levedura de mutantes PXR interagindo com sua coactivator, SRC-1. Usando esta abordagem, em que a levedura foi modificado para acomodar o estudo da droga antifúngica, cetoconazol, conseguimos demonstrar mutações específicas em PXR enriquecidas em clones incapazes de se ligar ao cetoconazol. Pela lógica inversa, podemos concluir que os resíduos originais são resíduos diretos de interação com cetoconazol. Este ensaio representa um romance, ensaio genético tratável para a tela por sítios de ligação do antagonista do receptor nuclear em superfícies. Este ensaio pode ser aplicado a qualquer medicamento, independentemente do seu potencial citotóxico de levedura, bem como a proteína (s) celular, que não pode ser estudado usando biologia estrutural padrão ou métodos proteomic base. Armadilhas potenciais incluem interpretação de dados (métodos complementares útil), reliance em método único Y2H, experiência em lidar com fermento ou levedura realizando ensaios de dois híbridos e otimização do ensaio.

Introduction

A levedura de dois híbridos (Y2H) ensaio é utilizado para descobrir as interacções proteína-proteína e, mais recentemente, para a descoberta de novas moléculas pequenas que perturbem complexos proteína-proteína de interacção ^{7, 8, 9, 10, 11.} No entanto, as abordagens convencionais deste ensaio, usado para a descoberta de medicamentos ou "hits", não permitem a detecção de resíduos de interação de compostos químicos alostéricos dentro superfícies proteína-proteína, que, quando alterados ainda interagir e permitir o interrogatório dos resíduos alterados ¹¹ . Com efeito, um tal método (s), se possível desenvolver, permitiria um sistema de levedura tratável para avaliação de alto rendimento de resíduos de interacção alostéricos críticos para a interacção proteína-proteína ruptura. No contexto da descoberta da droga, a maneira mais direta de estabelecer a interação de compostos com proteínas envolveria determinação estrutural (por exemplo, cristalização do complexo proteína-inibidor). Estes métodos são cumbersome, utilizar os recursos elaborados e não é tecnicamente viável a realização de estudos estruturais em cada proteína.

Sistemas de rastreio de drogas genética tratável foram estabelecidas em bactérias ^{1, 2} e outros sistemas modelo como mamíferos de dois híbridos. No entanto, esses sistemas precisam de otimização e sistemas alternativos como Y2H ainda são os mais testados na descoberta de medicamentos. Há limitações que incluem pouca sensibilidade e confiabilidade das interações usando métodos singulares ^13, no entanto, um ensaio Y2H único pode ser modificada para responder a perguntas específicas sobre resíduos de interação. No campo da investigação de receptores nucleares, Y2H foi usado para definir as proteínas que interagem ^14, no entanto, estas interacções proteína raramente foram utilizados para definir a natureza, em que os ligandos / antagonistas do receptor interajam com complexos proteicos nucleares. Assim, o nosso laboratório concentrado esforços na definição de um método, especialmente para as proteínas receptoras que não sejamprontamente passíveis de proteômica métodos baseados, que desenterrar novela ligante / antagonista interagindo resíduos utilizando uma plataforma baseada Y2H descoberta inversa.

Com base em nossa constatação anterior que o cetoconazol interrompe PXR e seu ativador SRC-1, foi desenvolvido um novo sistema de reverter Y2H que nos permitirá definir e interrogar cetoconazol interagir resíduos em PXR ^6. O nosso método baseia-se nas propriedades da proteína GAL4 de levedura, que consiste em domínios separáveis ​​responsáveis ​​pela activação de ligação a ADN e transcricional. A proteína PXR LBD é expressa como uma fusão com o domínio de ligação de LexA de ADN (DNA-BD), enquanto que as de comprimento total de co-activadores de SRC-1 (coactivator do receptor de esteróides 1) as proteínas são expressas como fusões com o domínio de activação de GAL4 (AD ). Interacção entre PXR e SRC-1 As proteínas de fusão conduz à activação da transcrição de GAL4, sítios de ligação que contêm genes repórter β-Lac Z, que é integrado no genom levedurae. Cetoconazol, um antagonista de PXR, interrompe PXR e SRC-1 interacção ^{15, 16, 17} e que pode detectar a interacção de PXR e SRC-1 na presença ou ausência de cetoconazol após coloração colónias em filtros para a actividade de X-gal. O princípio de Y2H é ilustrada na Figura 1 e o procedimento experimental é resumido na Figura 2.

Protocol

1. Construction of PXR and SRC-1 Fusions in Yeast Vectors PCR amplification of Human PXR LBD (107-434 amino acids) and Human SRC-1 full length (1-1401 amino acids). Use pSG5-hPXR plasmid8 as PXR LBD template, use pCMX-SRC1 plasmid as SRC-1 templates. Thaw PCR SuperMix, DNA templates and primers (see Materials), keep them on ice. Add 0.25 μg/μl DNA template 1 μl, 10 mM primer pairs 2 μl each, PCR SuperMix 45 μl and add H2O to brin…

Representative Results

We performed an assay to see if we could detect a colorimetric readout of the association of PXR and steroid receptor coactivator-1 (SRC-1). Since yeast has significant sterol production, it has previously been shown that lacZ expression in yeast can be induced without the need for additional exogenous ligand. We found that lacZ expression (blue colonies) is also induced in the yeast strain transformed with PXR and SRC-1; however, there is no induction of LacZ expression (white colonies) in yeast transformed with empty v…

Discussion

In our modified Y2H assay, we have identified important residues for ketoconazole interactions on PXR⁶. Since SRC-1 is a coactivator (and was cloned into the pGADNot vector), we also tested whether SRC-1 could activate lacZ expression when cloned into the pSH vector system and whether this would change the activation profile and/or affect the leakiness of the yeast two-hybrid assay. Using our redesigned plasmids we performed two-hybrid assays in erg3Δ/erg11Δ yeast. As before, we sho…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast Strain CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ	Our lab		CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 .
YPD Growth Medium	BD Biosciences	630409
Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate	BD Biosciences	233520
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture	MP Biomedicals	4250-412
ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranoside).	Sigma-Aldrich	N1127
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Luria Broth (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Fisher	BP-1615
Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml)	Life Technology	156-017
Ampicillin	Acros Organics	61177
Ketoconazole	Sigma-Aldrich	K1003
N,N-Dimethylformamide	Acros Organics	326871000
Lithium Acetate	Sigma-Aldrich	L4158
50% PEG-3350 solution, filter-sterilized	Sigma-Aldrich	P-3640
Nitrocellulose Membrane	Whatman	10402091
10 cm Petri Dish	Fisher	875712

5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'	our lab		PXR LBD forward primer for pSH2-1
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'	our lab		PXR LBD reverse primer for pSH2-1
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'	our lab		SRC-1 forward primer for pGADNOT
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'	our lab		SRC-1 reverse primer for pGADNOT
Platinum PCR Supermix	Invitrogen	11306-016
BamHI	our lab	R0136
SalI	our lab	R0138
NotI	our lab	R0189