En mikroskopisk fænotypisk analyse til kvantificering af intracellulære mycobakterier tilpasset til screening med højt gennemløb/højt indhold
Summary
Her beskriver vi en fænotypisk analyse, der gælder for high-throughput/high-content skærme af små-forstyrrende syntetisk RNA (siRNA), kemisk forbindelse, og Mycobacterium tuberkulose mutant biblioteker. Denne metode er baseret på påvisning af fluorescerende mærket Mycobacteriumtuberkulose i fluorescerende mærket værtscelle ved hjælp af automatiseret konfokal mikroskopi.
Abstract
På trods af tilgængeligheden af terapi og vaccine er tuberkulose (TB) fortsat en af de mest dødelige og udbredte bakterieinfektioner i verden. Siden flere årtier har den pludselige udbrud af multi- og ekstensivt resistente stammer er en alvorlig trussel for kontrollen med tuberkulose. Det er derfor vigtigt at identificere nye mål og veje, der er kritiske for det årsagsfremkaldende middel for tuberkulose, Mycobacteriumtuberkulose (Mtb), og at søge efter nye kemikalier, der kan blive TB-lægemidler. En metode er at etablere metoder, der passer til de genetiske og kemiske skærme i store biblioteker, der gør det muligt at søge efter en nål i en høstak. Til dette formål udviklede vi en fænotypisk analyse, der var afhængig af påvisning af fluorescerende mærket Mtb i fluorescerende mærkede værtsceller ved hjælp af automatiseret konfokal mikroskopi. Denne in vitro-analyse giver mulighed for en billedbaseret kvantificering af koloniseringsprocessen af Mtb ind i værten og blev optimeret til 384-brønds mikropladeformatet, hvilket er korrekt for skærme af siRNA-, kemisk forbindelses- eller Mtb mutantbiblioteker. Billederne behandles derefter til multiparametrisk analyse, som giver udlæsning af Mtb’s patogenese i værtsceller.
Introduction
Blandt de nye og genopståede smitsomme patogener, der er rapporteret i løbet af de seneste år, har Mycobacteriumtuberkulose (Mtb) en fremtrædende plads som ansvarlig for 1,4 millioner dødsfald og 8,7 millioner nye infektioner i 2011 (Global tuberkuloserapport 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). På trods af tilgængeligheden af multidrug behandlinger, antallet af smittede mennesker er stadig stigende og multidrug resistente (MDR) samt omfattende resistente (XDR) Mtb er hurtigt breder sig over hele verden1. Desuden er det, når man tager hensyn til tilstedeværelsen af Mtb-antigener, tydeligt, at en tredjedel af den globale befolkning anses for at være latent inficeret af Mtb. Statistisk set er der i et tilfælde ud af ti udvikling i retning af sygdommens aktive form med efterfølgende kliniske symptomer2. Derfor er der et presserende behov for nye midler til at bekæmpe Mtb. I denne sammenhæng udviklede vi en in vitro visuel fænotypisk analyse, der var afhængig af overvågning af Mtb-invasion og multiplikation i værtsceller ved automatiseret konfokal fluorescensmikroskopi3. Tilpasningen af analysen i 384-brønds mikrotiterplader i kombination med automatiseret billederhvervelse og analyse tillod high-content/high-throughput Screening (HC/HTS) af mellemstore biblioteker af forbindelser, siRNA’er og bakteriede mutanter. Screeningen af et genom bredt RNAi bibliotek på denne fænotypiske analyse således gjort det muligt at identificere de vigtigste værtsfaktorer, der er involveret i Mtb handel og intracellulær replikation, men også belysning af værtsveje udnyttes af tuberkel bacillus. En anden tilpasning af denne særlige fænotypiske analyse var til identifikation af bakterielle faktorer, der er afgørende for Mtb intra-fagosomal persistens. For eksempel betragtes anholdelsen af fagadær modning som en af de vigtigste mekanismer, der letter overlevelse og replikation af Mtb i makrofag. Overvågning af subcellulær lokalisering af Mtb knock-out mutanter i fluorescerende mærkede syreholdige rum gjorde det muligt at identificere bakterielle gener, der er involveret i overlevelsesprocessen4. Endelig giver billeddannelsen af Mtb med højt indhold også en fremragende metode til at kvantificere lægemiddeleffektivitet til at hæmme forskellige fænomener som intracellulær bakterievækst3. Alt i alt giver denne type høj gennemløbsfenotypisk analyse mulighed for at fremskynde lægemiddelopdagelse mod TB, og de data, der indsamles af disse forskellige tilgange, bidrager til en bedre forståelse af værtsmanipulationen udøvet af Mtb.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver her de metoder, der kræves for en fænotypisk analyse ved hjælp af en GFP-udtrykkende Mtb H37Rv-stamme for at inficere fluorescerende mærkede værtsceller, hvilket gør det hensigtsmæssigt for skærme med højt indhold/høj gennemløb. Denne protokol kan anvendes på en bred vifte af forbindelser, fluorescerende sonder og Mtb mutanter. For hver protokol, der er beskrevet ovenfor, kan fikserings- og immunolabelingstrin udføres inden billederhvervelse. Vi bruger et automatiseret fluoresc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den finansielle støtte til dette arbejde blev ydet af Det Europæiske Fællesskab (ERC-STG INTRACELLTB Grant nr. 260901, MM4TB Grant nr. 260872), Agence Nationale de Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) og Regionen Nord Pas de Calais. Vi anerkender taknemmeligt den tekniske bistand fra Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni og Frank Lafont fra platformen BICeL.
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
