Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud
Summary
Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.
Abstract
Ondanks de beschikbaarheid van therapie en vaccin blijft tuberculose (tbc) een van de meest dodelijke en wijdverspreide bacteriële infecties ter wereld. Sinds enkele decennia is de plotselinge uitbarsting van multi- en uitgebreid resistente stammen een ernstige bedreiging voor de bestrijding van tuberculose. Daarom is het essentieel om nieuwe doelen en paden te identificeren die van cruciaal belang zijn voor de veroorzaker van de tuberculose, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en om te zoeken naar nieuwe chemicaliën die tbc-medicijnen kunnen worden. Een aanpak is het opzetten van methoden die geschikt zijn voor de genetische en chemische schermen van grootschalige bibliotheken, waardoor het zoeken naar een naald in een hooiberg mogelijk is. Hiervoor ontwikkelden we een fenotypische test gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mtb in fluorescerend gelabelde hostcellen met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie. Deze in vitro test maakt een beeldgebaseerde kwantificering van het kolonisatieproces van Mtb in de host mogelijk en is geoptimaliseerd voor het 384-well microplate-formaat, dat geschikt is voor schermen van siRNA-, chemische verbindingen- of Mtb-mutantbibliotheken. De beelden worden vervolgens verwerkt voor multiparametrische analyse, die voorlezen geeft over de pathogenese van Mtb in gastheercellen.
Introduction
Onder de opkomende en opnieuw opkomende infectieuze pathogenen die de afgelopen jaren zijn gemeld, heeft Mycobacterium tuberculosis (Mtb) een prominente plaats in voor 1,4 miljoen sterfgevallen en 8,7 miljoen nieuwe infecties in 2011 (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Ondanks de beschikbaarheid van multidrug therapieën, het aantal geïnfecteerde mensen is nog steeds in opkomst en multidrug resistente (MDR) evenals uitgebreid drug resistente (XDR) Mtb zijn snel verspreid over de hele wereld1. Bovendien, wanneer rekening wordt gehouden met de aanwezigheid van Mtb-antigenen, is het duidelijk dat een derde van de wereldbevolking wordt beschouwd als latent geïnfecteerd door Mtb. Statistisch gezien is er in één van de tien gevallen evolutie naar de actieve vorm van de ziekte met daaropvolgende klinische symptomen2. Daarom zijn er dringend nieuwe middelen nodig om Mtb te bestrijden. In deze context ontwikkelden we een in vitro visuele fenotypische test gebaseerd op het monitoren van Mtb-invasie en -vermenigvuldiging in gastheercellen door geautomatiseerde confocale fluorescentiemicroscopie3. De aanpassing van de test in 384-well microtiterplaten in combinatie met geautomatiseerde beeldverwerving en -analyse maakte High-content/High-throughput Screening (HC/HTS) van middelgrote bibliotheken van verbindingen, siRNAs en bacteriële mutanten mogelijk. De screening van een genoombrede RNAi-bibliotheek op deze fenotypische test maakte het dus mogelijk om de belangrijkste gastheerfactoren te identificeren die betrokken zijn bij Mtb-handel en intracellulaire replicatie, maar ook de opheldering van gastheerroutes die door de tuberkel bacillus worden geëxploiteerd. Een andere aanpassing van deze specifieke fenotypische test was voor de identificatie van bacteriële factoren die essentieel zijn voor Mtb intra-phagosomale persistentie. De arrestatie van fagosome rijping wordt bijvoorbeeld beschouwd als een van de belangrijkste mechanismen die het overleven en repliceren van Mtb in macrofaag vergemakkelijkt. De monitoring van de subcellulaire lokalisatie van Mtb knock-out mutanten in fluorescerend gelabelde zure compartimenten maakte het mogelijk om bacteriële genen te identificeren die betrokken zijn bij het overlevingsproces4. Ten slotte biedt de hoog-inhoud beeldvorming van Mtb ook een uitstekende methode om de efficiëntie van geneesmiddelen te kwantificeren voor het remmen van verschillende verschijnselen zoals intracellulaire bacteriële groei3. Al met al maakt dit type fenotypische test met hoge doorvoer het mogelijk om de ontdekking van geneesmiddelen tegen tbc te versnellen en de gegevens die door deze verschillende benaderingen worden verzameld, dragen bij aan een beter begrip van de gastheermanipulatie die door Mtbwordt uitgeoefend .
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven hier de methoden die nodig zijn voor een fenotypische test met behulp van een GFP-expresserende Mtb H37Rv-stam om fluorescerend gelabelde hostcellen te infecteren, waardoor het geschikt is voor schermen met een hoog gehalte / hoge doorvoer. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala aan verbindingen, fluorescerende sondes en Mtb-mutanten. Voor elk hierboven beschreven protocol kunnen fixatie- en immunolabelingstappen worden uitgevoerd voorafgaand aan het verkrijgen van afbeeldi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiële steun voor deze werkzaamheden werd verleend door de Europese Gemeenschap (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), de Agence Nationale de Recherche, de Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) en de regio Nord Pas de Calais. We erkennen dankbaar de technische assistentie van Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni en Frank Lafont van het platform BICeL.
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
