Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil
Summary
Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis’in tespitine dayanır.
Abstract
Tedavi ve aşı mevcudiyetine rağmen, tüberküloz (TB) dünyadaki en ölümcül ve yaygın bakteriyel enfeksiyonlardan biri olmaya devam etmektedir. Birkaç on yıldan bu yana, çok ve yaygın olarak ilaca dirençli suşların ani patlaması tüberkülozun kontrolü için ciddi bir tehdittir. Bu nedenle, tüberkülozun etken maddesi olan Mycobacterium tuberculosis(Mtb)için kritik olan yeni hedeflerin ve yolların belirlenmesi ve TB ilaçları olabilecek yeni kimyasalların araştırılması esastır. Bir yaklaşım, samanlıkta iğne aranmasını sağlayan büyük ölçekli kütüphanelerin genetik ve kimyasal ekranlarına uygun yöntemler kurmaktır. Bu amaçla, otomatik konfokal mikroskopi kullanarak floresan etiketli konak hücreler içinde floresan etiketli Mtb’nin tespitine dayanan fenotipik bir test geliştirdik. Bu in vitro test, Mtb’nin kolonileşme sürecinin konakçıya görüntü bazlı nicelleştirilmesine izin verir ve siRNA, kimyasal bileşik veya Mtb mutant kütüphanelerinin ekranları için uygun olan 384 kuyu mikro plaka formatı için optimize edilmiştir. Görüntüler daha sonra konak hücreler içindeki Mtb patogenezinde okuma çıkarımını sağlayan çokparametrik analiz için işlenir.
Introduction
Son yıllarda bildirilen ortaya çıkan ve yeniden ortaya çıkan bulaşıcı patojenler arasında, Mycobacterium tuberculosis (Mtb),2011 yılında 1,4 milyon ölümden ve 8,7 milyon yeni enfeksiyondan sorumlu olarak önemli bir yer tutmaktadır (Küresel tüberküloz raporu 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Multidrug tedavilerinin mevcudiyetine rağmen, enfekte insan sayısı hala artmaktadır ve çok halıya dayanıklı (MDR) ve yaygın olarak ilaca dirençli (XDR) Mtb hızla tüm dünyaya yayılmaktadır1. Ayrıca, Mtb antijenlerinin varlığı dikkate alındığında, küresel nüfusun üçte birinin Mtb tarafından gizlice enfekte olduğu düşünülmektedir. İstatistiksel olarak, on vakadan birinde, sonraki klinik semptomlarla hastalığın aktif formuna doğru evrim vardır2. Bu nedenle, Mtb ile savaşmak için acilen yeni araçlara ihtiyaç vardır. Bu kapsamda, otomatik konfokal floresan mikroskopisi3 . Tahlilin 384 kuyulu mikrotiter plakalarda otomatik görüntü alma ve analiz ile birlikte uyarlanması, orta ölçekli bileşik, siRNA ve bakteriyel mutant kütüphanelerinin Yüksek içerikli / Yüksek verimli Taramaya (HC / HTS) izin verdi. Bu fenotipik test üzerinde genom geniş bir RNAi kütüphanesinin taranması, böylece Mtb kaçakçılığı ve hücre içi replikasyonda yer alan temel konak faktörlerinin tanımlanmasını ve aynı zamanda tüberkül basil basili tarafından sömürülen konak yolların aydınlatılmasını sağladı. Bu özel fenotipik tahlilin bir diğer adaptasyonu da Mtb intra-fagozomal kalıcılık için gerekli bakteriyel faktörlerin tanımlanmasıydı. Örneğin, fagozom olgunlaşmasının tutuklanması, Mtb’nin makrofajda hayatta kalmasını ve replikasyonunu kolaylaştıran önemli mekanizmalardan biri olarak kabul edilir. Mtb nakavt mutantlarının floresan etiketli-asidik bölmelerde hücre altı lokalizasyonunun izlenmesi, sağkalım sürecinde yer alan bakteri genlerinin tanımlanmasına izin verdi4. Son olarak, Mtb’nin yüksek içerikli görüntülemesi, hücre içi bakteri üremesi gibi çeşitli fenomenleri inhibe etmek için ilaç verimliliğini ölçmek için mükemmel bir yöntem sunar3. Tamamen, bu tür yüksek verimli fenotipik test, TB’ye karşı ilaç keşfini hızlandırmaya izin verir ve bu farklı yaklaşımlarla toplanan veriler Mtbtarafından uygulanan konak manipülasyonunun daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, yüksek içerikli / Yüksek verimli ekranlar için uygun hale getiren floresan etiketli konak hücreleri enfekte etmek için GFP ifade eden bir Mtb H37Rv suşu kullanarak fenotipik bir test için gerekli yöntemleri açıklıyoruz. Bu protokol çok çeşitli bileşiklere, floresan problara ve Mtb mutantlarına uygulanabilir. Yukarıda açıklanan her protokol için, görüntü alımından önce fiksasyon ve immünolabeling adımları gerçekleştirilebilir. Görüntü elde etmek için 20X (NA 0….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma için finansal destek Avrupa Topluluğu (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), Agence Nationale de Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) ve Nord Pas de Calais Bölgesi tarafından sağlanmıştır. BICeL platformundan Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni ve Frank Lafont’un teknik yardımını minnetle kabul ediyoruz.
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
