Bacteriën kunnen tijdens hun leven schadelijke of gunstige mutaties ophopen. In een populatie van cellen kunnen individuen die gunstige mutaties hebben geaccumuleerd, snel hun medemens overtreffen. Hier presenteren we een eenvoudige procedure om intraspecies-concurrentie in een bacteriële celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren met behulp van fluorescerend gelabelde individuen.
Veel micro-organismen zoals bacteriën verspreiden zich extreem snel en de populaties kunnen hoge celdichtheden bereiken. Kleine fracties van cellen in een populatie hebben altijd geaccumuleerde mutaties die schadelijk of gunstig zijn voor de cel. Als het fitnesseffect van een mutatie de subpopulatie een sterk selectief groeivoordeel biedt, kunnen de individuen van deze subpopulatie snel overcompeteren en zelfs hun directe medemensen volledig elimineren. Kleine genetische veranderingen en selectiegestuurde accumulatie van cellen die gunstige mutaties hebben verworven, kunnen dus leiden tot een volledige verschuiving van het genotype van een celpopulatie. Hier presenteren we een procedure om de snelle klaonale expansie en eliminatie van respectievelijk gunstige en schadelijke mutaties in een bacteriecelpopulatie in de loop van de tijd te monitoren door cocultivatie van fluorescerend gelabelde individuen van de Gram-positieve modelbacterie Bacillus subtilis. De methode is gemakkelijk uit te voeren en zeer illustratief om intraspecies concurrentie weer te geven tussen de individuen in een bacteriële celpopulatie.
Bodembacteriën zijn meestal begiftigd met flexibele regulerende netwerken en brede metabolische capaciteiten. Beide functies stellen de cellen in staat om hun katabole en anabole paden aan te passen om te concurreren met hun collega’s en andere micro-organismen voor de voedingsstoffen, die beschikbaar zijn in een bepaalde ecologische niche1. Als de bacteriën zich echter niet kunnen aanpassen aan hun omgeving, kunnen andere mechanismen het voortbestaan van een soort verklaren. Inderdaad, omdat veel bacteriën zich snel verspreiden en de populaties hoge celdichtheden kunnen bereiken, kunnen subpopulaties spontaan gunstige mutaties hebben geaccumuleerd die de cellen een selectief groeivoordeel bieden en daarom hun conditie verhogen. Bovendien kunnen mutatiehotspots en stress-geïnduceerde adaptieve mutagenese de evolutie van een maladapted bacterie2,3vergemakkelijken. Accumulatie van mutaties en groei onder continue selectie is dus de oorsprong voor de enorme microbiële diversiteit, zelfs binnen hetzelfde geslacht4,5. Net als in de natuur komt het vormen van bacteriële genomen ook voor in het laboratorium als gevolg van continue teelt onder selectie. Dit wordt geïllustreerd door de domesticatie van de Gram-positieve bacterie B. subtilis, die wereldwijd wordt gebruikt in fundamenteel onderzoek en in de industrie. In de jaren 1940 werd B. subtilis behandeld met DNA-schadelijke röntgenfoto’s gevolgd door teelt onder een specifieke groeitoestand6. De mutaties die zich tijdens hun domesticatie in de bacteriën hebben opgehoopt, zijn verantwoordelijk voor het verlies van veel groeikenmerken, d.w.z. de B. subtilis laboratoriumstam 168 verloor het vermogen om complexe kolonies te vormen7,8.
Tegenwoordig is voor de best bestudeerde modelbacteriën Escherichia coli en B. subtiliseen verscheidenheid aan krachtige hulpmiddelen beschikbaar om hun genomen genetisch te manipuleren om specifieke wetenschappelijke vragen te beantwoorden. Soms veroorzaakt de inactivatie van een interessant gen een ernstig groeidefect, dat dan duidelijk zichtbaar is op standaard groeimedium9. Mutaties die daarentegen een zwak groeidefect veroorzaken en dus slechts een geringe invloed hebben op de conditie van de stam, worden vaak genegeerd. In beide gevallen resulteren langdurige incubatie en passaging van de mutante stammen gedurende meerdere generaties echter meestal in de accumulatie van suppressor mutanten die het fenotype van de ouderstam hebben hersteld2,9. De karakterisering van suppressor mutanten en de identificatie van de mutaties die het groeidefect van de parent mutant stam hebben hersteld is een zeer nuttige benadering die opheldering van belangrijke en vaak nieuwe cellulaire processen mogelijk maakt10,11.
Wij zijn geïnteresseerd in de bestrijding van glutamaat homeostase in B. subtilis12. Net als E. colireageert B. subtilis op verstoring van glutamaathomeostase (d.w.z.blok in glutamaatdegradatie2) door de accumulatie van suppressormutanten. De genomische veranderingen in deze suppressor mutanten die werden verkregen door spontane mutatie bleken glutamaat homeostase snel te herstellen9,13. Daarom is het niet verwonderlijk dat aanpassing van B. subtilis aan een specifieke groeitoestand tijdens domesticatie van de bacterie wordt weerspiegeld in enzymsynthese en in de geëvolueerde enzymatische activiteiten, die betrokken zijn bij glutamaatmetabolisme12. Er is gesuggereerd dat het gebrek aan exogene glutamaat in het groeimedium tijdens het domesticatieproces de drijvende kracht was voor het ontstaan en fixeren van het cryptische glutamaatdehydrogenase (GDH) gudBCR-gen in de laboratoriumstam 1682,14. Deze hypothese wordt ondersteund door onze observatie dat de verminderde hoeveelheid GDH-activiteit in de laboratoriumstam de bacteriën een selectief groeivoordeel biedt wanneer exogene glutamaat schaars is2. Bovendien resulteert de teelt van een B. subtilis stam, het synthetiseren van de GDH GudB, bij afwezigheid van exogene glutamaat in de accumulatie van suppressor mutanten die het gudB gen2hebben geactiveerd . Het is duidelijk dat de aanwezigheid van een katabolisch actieve GDH nadelig is voor de cel omdat endogene glutamaat dat anders voor anabolisme zou kunnen worden gebruikt, wordt afgebroken tot ammonium en 2-oxoglutaraat (figuur 1). Wanneer glutamaat daarentegen door het medium wordt geleverd, heeft een B. subtilis-stam die is uitgerust met GDH-activiteit op hoog niveau een selectief groeivoordeel ten opzichte van een soort die slechts één functionele GDH synthetiseert. Het is redelijk om aan te nemen dat GDH-activiteit op hoog niveau de bacteriën in staat stelt glutamaat als tweede koolstofbron te gebruiken naast andere koolstofbronnen die door het medium2 worden geleverd (zie figuur 1). GDH-activiteit heeft dus een sterke invloed op de geschiktheid van bacteriën, afhankelijk van de beschikbaarheid van exogene glutamaat.
Hier presenteren we een zeer illustratieve methode om de intraspecies-competitie tussen twee B. subtilisstammen die verschillen in een enkele locus op het chromosoom te monitoren en te visualiseren (Figuur 2). De twee stammen werden gelabeld met de yfp- en cfp-genen die coderen voor de fluoroforen YFP en GVB, en gecocultiveerd onder verschillende voedingsomstandigheden. Door na verloop van tijd te bemonsteren en door geschikte verdunningen op agarplaten te plateren, konden de overlevenden in elk van de culturen gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van een gemeenschappelijke stereofluorescentiemicroscoop. De procedure die in dit artikel wordt beschreven, is eenvoudig uit te voeren en geschikt om de snelle klaonale expansie en eliminatie van respectievelijk gunstige en schadelijke mutaties in een celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren.
Verschillende methoden zijn ontwikkeld om de competitieve fitheid van bacteriën te analyseren16. In veel gevallen werden de bacteriën gelabeld met verschillende antibioticaresistentiecassettes17. Net als bij onze aanpak maakt het labelen van de cellen met antibioticaresistentiecassettes het mogelijk om de competitieve geschiktheid van de bacteriën tijdens cocultivatie onder gedefinieerde groeiomstandigheden te evalueren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de competitieve geschiktheid t…
The authors have nothing to disclose.
Het werk in het laboratorium van de auteurs werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), het Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) en het Göttingen Centre for Molecular Biology (GZMB). De auteurs willen Jörg Stülke erkennen voor nuttige opmerkingen en kritische lezing van het manuscript.
(NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | – |
Agar | Difco, USA | 214010 | – |
Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | – |
CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | – |
Glucose | Applichem, Germany | A3617 | – |
Glycerol | Roth, Germany | 4043 | – |
K2HPO4 x 3 H2O | Roth, Germany | 6878 | – |
KCl | Applichem, Germany | A3582 | – |
KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | – |
KOH | Roth, Germany | 6751 | – |
MgSO4 x 7 H2O | Roth, Germany | P027 | – |
MnCl2 | Roth, Germany | T881 | – |
MnSO4 x 4 H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | – |
NaCl | Roth, Germany | 9265 | – |
Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | – |
Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | – |
Tryptone | Roth, Germany | 8952 | – |
Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | – |
Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | – |
1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | – |
2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | – |
15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | – |
Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | – |
1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | – |
15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | – |
with aluminium caps | |||
100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | – |
Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | – |
Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | – |
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | – |
4910 000.042, | |||
4910 000.069 | |||
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | – |
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | – |
Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | – |
Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | – |
Freezer (-20 and -80 °C) | – | – | – |
Fridge (4 °C) | – | – | – |
Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | – | – |
pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | – |
Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | – |
Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | – |
CPA2202S | |||
Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | – |
Powerpoint program | Microsoft, USA | – | – |
Office Excel program | Microsoft, USA | – | Program for data processing |
Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
Computer | PC or Mac | – | – |
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
Specific solution recipes | |||
SP medium | |||
8 g Nutrient broth | |||
0.25 mg MgSO4 x 7 H2O | |||
1 g KCl | |||
if required, add 15 g agar for solid SP medium | |||
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration | |||
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
LB medium | |||
10 g Tryptone | |||
5 g Yeast extract | |||
10 g NaCl | |||
if required, add 15 g agar for solid LB medium | |||
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
C-Glc minimal medium | |||
200 ml 5 x C salts | |||
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
10 ml III’ salts | |||
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
ad 1 l with sterile H2O | |||
CE-Glc minimal medium | |||
200 ml 5 x C salts | |||
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
10 ml III’ salts | |||
20 ml Glutamate (40%) | |||
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
ad 1 l with sterile H2O | |||
5 x C salts | |||
20 g KH2PO4 | |||
80 g K2HPO4 x 3 H2O | |||
16.5 g (NH4)2SO4 | |||
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
III’ salts | |||
0.232 g MnSO4 x 4 H2O | |||
12.3 g MgSO4 x 7 H2O | |||
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
40% Glutamate solution | |||
200 g L-Glutamic acid | |||
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
0.9% Saline (NaCl) solution | |||
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
50% Glycerol solution | |||
295 ml Glycerol (87%) | |||
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) |