형광표균의 세균세포 인구에 대한 종 내 경쟁 모니터링

Summary

박테리아는 그들의 일생 도중 해롭거나 유익한 돌연변이를 축적할 수 있습니다. 유익한 돌연변이를 축적한 세포 개인의 인구에서 그들의 동료를 급속하게 능가할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표시된 개별을 사용하여 시간이 지남에 따라 세균성 세포 인구에 있는 종 경쟁을 구상하는 간단한 절차를 제시합니다.

Abstract

박테리아와 같은 많은 미생물은 매우 빠르게 증식하고 인구는 높은 세포 밀도에 도달 할 수 있습니다. 인구에 있는 세포의 작은 분수는 항상 세포에 해를 끼치거나 유익한 돌연변이를 축적했습니다. 돌연변이의 체력 효과가 강한 선택적 성장 이점을 가진 하위 인구를 제공하는 경우에, 이 하위 인구의 개별은 급속하게 경쟁하고 그들의 즉각적인 동료를 완전히 제거할 수 있습니다. 따라서, 유익한 돌연변이를 획득한 세포의 작은 유전적 변화 및 선택 중심축적은 세포 집단의 유전자형의 완전한 변화로 이어질 수 있다. 여기서 우리는 그람 양성 모델 박테리아 부틸리스의형광 표시 개인의 공동 재배에 의해 시간이 지남에 따라 세균 세포 인구에서 각각 유익하고 해로운 돌연변이의 급속한 클로날 팽창 및 제거를 모니터링하는 절차를 제시한다. 이 방법은 세균 세포 집단의 개인 들 간의 종 내 경쟁을 표시하는 것이 쉽고 매우 예시적입니다.

Introduction

토양 박테리아는 일반적으로 유연한 규제 네트워크와 광범위한 신진 대사 용량을 부여합니다. 두 가지 기능을 모두 사용하면 세포가 쌍백과 단백 동화 경로를 조정하여 주어진 생태 틈새 시장^1에서사용할 수있는 영양소를 위해 동료 및 기타 미생물과 경쟁 할 수 있습니다. 그러나, 박테리아가 그들의 환경에 적응할 수 없는 경우에 그밖 기계장치는 종의 생존을 설명할 수 있습니다. 실제로, 많은 박테리아가 빠르게 증식하고 인구가 높은 세포 밀도에 도달할 수 있기 때문에 인구 하위 인구는 선택적 성장 이점을 가진 세포를 제공하고 그러므로 그들의 적정성을 증가시키는 유익한 돌연변이를 자발적으로 축적할 수 있습니다. 더욱이, 돌연변이 핫스팟 및 스트레스 유발 적응 돌연변이 발생은 부적응된 박테리아^2,3의진화를 용이하게 할 수 있다. 따라서, 연속선택 하에서 돌연변이와 성장의 축적은 동일한^4,5세내에서도 엄청난 미생물 다양성의 기원이다. 자연에서와 마찬가지로, 세균 게놈의 형성은 또한 선택하에 지속적인 재배 때문에 실험실에서 발생합니다. 이것은 기본 연구 및 산업에서 전 세계적으로 사용되는 그람 양성 박테리아 B. subtilis의 길들여지는 것으로 예시됩니다. 1940년대에 B. 서브틸리스는 DNA 손상 엑스레이로 처리되었고, 그 다음에는 특정 성장 조건 하에서 재배하였다^6. 이들의 가축화 과정에서 축적된 돌연변이는 많은 성장 특성의 상실을 차지하고, 즉 B. 서브틸리스 실험실 균주(168)는 복잡한 식민지를 형성하는 능력을^{상실하였다 7,8.}

요즘, 가장 잘 연구 된 모델 박테리아 Escherichia 대장균과 B. subtilis에대 한, 다양 한 강력한 도구는 유전 특정 과학적 질문을 해결 하기 위해 그들의 게놈을 조작하는 사용할 수 있습니다. 때때로 관심 유전자의 불활성화는 심각한 성장 결함을 일으키는 원인이 되고, 그 때 표준 성장 매체^9에서명확하게 보입니다. 대조적으로, 약한 성장 결함을 일으키는 원인이 되고 이렇게 약간 만 긴장의 적각에 약간 영향을 미치는 돌연변이는 수시로 무시됩니다. 그러나, 두 경우 모두 여러 세대에 대한 돌연변이 균주의 장기간 인큐베이션 및 패시징은 일반적으로 부모 균주^2,9의표현형을 복원한 억제제 돌연변이체의 축적을 초래한다. 억제제 돌연변이의 특성화 및 부모 돌연변이 균주의 성장 결함을 복원한 돌연변이의 식별은 중요하고 종종 새로운 세포 과정의 명분보정을 허용하는 매우 유용한^{접근법이다 10,11.}

우리는 B. subtilis^12에서글루타민성 항상성의 제어에 관심이 있습니다. 대장균과유사하게, B. 서브틸리스는 억제제 돌연변이의 축적에 의해 글루타민트 항상성(즉, 글루타민제 분해^2의블록)의 변투에 반응한다. 자발적인 돌연변이에 의해 획득한 이들 억제돌연변이의 게놈 변화는 글루타민트 항상성을 급속히 회복시키는 것으로 나타났다^9,13. 따라서, 박테리아의 국산 후 특정 성장 상태에 B. 아틸리스의 적응이 효소 합성및 조미료 대사에 관여하는 진화된 효소 활동에서 미러링된다는 것은 놀라운 일이^{아니다.12.} 국내화 과정에서 성장 배지에서 외인성 글루타민의 부재가 실험실 균주 168^2,14에서비밀글루타민제 탈수소효소(GDH) gudB^CR 유전자의 출현 및 고정을 위한 원동력이 되었다는 것이 시사되고 있다. 이러한 가설은 실험실 균주에서 의한 GDH 활성의 감소된 양이 외인성 글루타민산염이 부족할 때 선택적 성장 이점을 박테리아에 제공한다는 우리의 관측에 의해 지원된다^2. 더욱이, B. subtilis 균주의 재배, GDH GudB를 합성, 외인성 글루타민의 부재시 gudB 유전자^2를불활성화한 억제제 돌연변이의 축적을 초래한다. 명백하게, 이화 활성 GDH의 존재는 비물질에 사용될 수 있는 내인성 생산 글루타민산염이 암모늄및 2-oxoglutaraterate(도1)로저하되기 때문에 세포에 불리하다. 대조적으로, 글루타민이 매체에 의해 제공될 때, 높은 수준의 GDH 활성을 갖춘 B. 서브틸리스 균주는 하나의 기능성 GDH만 합성하는 균주에 비해 선택적 성장 우위를 가지게 한다. 높은 수준의 GDH 활성이 박테리아가 중간^2에서 제공하는 다른 탄소 공급원 이외에 글루타민을 제2 탄소 원으로 활용할 수 있다고 가정하는 것이 합리적이다(도 1참조). 따라서, GDH 활동은 외인성 글루타민산염의 가용성에 따라 박테리아의 적합성에 강하게 영향을 미친다.

여기서 우리는 염색체에 단일 궤적(도 2)에서다른 두 B. 아틸리스 균주 사이의 종 내 경쟁을 모니터링하고 시각화하는 매우 예시적인 방법을 제시한다. 두 균주는 형광YFP와 CFP를 인코딩yfp 및 cfp 유전자로 표시하고, 다른 영양 조건하에서 cocultivate. 시간이 지남에 따라 샘플링하고 각 배양소의 생존자는 일반적인 스테레오 형광 현미경을 사용하여 쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 본 논문에 기재된 절차는 시간이 지남에 따라 세포 집단에서 각각 유익하고 해로운 돌연변이의 급속한 클로날 팽창 및 제거를 시각화하기 쉽고 적합합니다.

Protocol

1. 한천 접시, 문화 매체, 극저온, 프리컬쳐 준비 성장 매체와 필요한 시약을 준비합니다(재료 및 시약 표 참조). B. 서브틸리스 균주(예:. BP40(rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)및 BP52(rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)각각 1개와 2개의 활성 GDHs를 발현)2는 SP 중간 식도 플레이트에 대한 경쟁 실?…

Representative Results

여기서 설명된 방법은 각각 형광경 CFP와 YFP를 인코딩하는 cfp 및 yfp 유전자로 표지된 B. 서브틸리스 균주로 구성된 세포 집단에서 종 내 경쟁을 시각화하기 위해 성공적으로 적용되었다. 도 3에도시된 바와 같이, 이 방법은 매우 예시적인 방식으로 종내 경쟁을 시각화하는 데 사용될 수 있다. 작은 부위에 샘플을 발견함으로써 세포 집단의 복제 구성을 한눈에 볼 수 …

Discussion

박테리아^16의경쟁력있는 적합성을 분석하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 많은 경우에 박테리아는 다른 항생 저항 카세트^17로표지되었습니다. 우리의 접근 방식과 유사하게, 항생제 저항 카세트를 가진 세포의 라벨링은 정의된 성장 조건하에서 박테리아의 경쟁적 적합성의 평가를 허용합니다. 더욱이, 이 방법은^{염색체(17)에}특정 궤적에서 서로 다른 세포의 경쟁?…

Materials

(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746	–
Agar	Difco, USA	214010	–
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714	–
CaCl2	Roth, Germany	5239	–
Glucose	Applichem, Germany	A3617	–
Glycerol	Roth, Germany	4043	–
K2HPO4 x 3 H2O	Roth, Germany	6878	–
KCl	Applichem, Germany	A3582	–
KH2PO4	Roth, Germany	3904	–
KOH	Roth, Germany	6751	–
MgSO4 x 7 H2O	Roth, Germany	P027	–
MnCl2	Roth, Germany	T881	–
MnSO4 x 4 H2O	Merck Millipore, Germany	102786	–
NaCl	Roth, Germany	9265	–
Nutrient broth	Roth, Germany	X929	–
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712	–
Tryptone	Roth, Germany	8952	–
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445	–
Yeast extract	Roth, Germany	2363	–
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001	–
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691	–
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001	–
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473	–
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742	–
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22	–
with aluminium caps
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24	–
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23	–
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012	–
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,	–
		4910 000.042,
		4910 000.069
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425	–
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440	–
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21	–
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000	–
Freezer (-20 and -80 °C)	–	–	–
Fridge (4 °C)	–	–	–
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	–	–
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766	–
Vortex	Vortex  3, IKA, Germany	3340000	–
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by	–
		CPA2202S
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9	–
Powerpoint program	Microsoft, USA	–	–
Office Excel program	Microsoft, USA	–	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	–	–
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4 x 7 H2O
1 g KCl
if required, add 15 g agar for solid SP medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM) sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
if required, add 15 g agar for solid LB medium
ad 1 l with H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
CE-Glc minimal medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
ad 1 l with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4 x 3 H2O
16.5 g (NH4)2SO4
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4 x 4 H2O
12.3 g MgSO4 x 7 H2O
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) solution
ad 1 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
ad 0.5 l with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)			Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)