पूर्व mRNA Substrates के 3 'अंत विखंडन: सेल फ्री सिस्टम का प्रयोग शाही सेना प्रसंस्करण प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण<em> इन विट्रो</em
Summary
शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय परिपक्व mRNA की 3 'के अंत से परे फैली हुई है कि एक अग्रदूत आरएनए synthesizes. परिपक्व शाही सेना के अंत दरार परिसर के endonuclease गतिविधि के माध्यम से, आरएनए दृश्यों से तय एक साइट पर, cotranscriptionally उत्पन्न होता है. इधर, विस्तार विट्रो में दरार प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विधि हम.
Abstract
स्तनधारी mRNAs का 3 'अंत शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय (RNPII) द्वारा प्रतिलेखन की अचानक समाप्ति द्वारा गठित नहीं है. इसके बजाय, RNPII परिपक्व RNAs के अंत से परे अग्रदूत mRNA synthesizes, और endonuclease गतिविधि के एक सक्रिय प्रक्रिया एक विशिष्ट स्थल पर आवश्यक है. अग्रदूत शाही सेना के विखंडन सामान्य रूप से सीए dinucleotides के बाद आम सहमति Pólya साइट (AAUAAA) से नीचे की ओर NT 10-30 होता है. दरार जटिल, लगभग 800 केडीए के एक multifactorial प्रोटीन जटिल, से प्रोटीन इस विशिष्ट nuclease गतिविधि को पूरा. विशिष्ट शाही सेना दृश्यों नदी के ऊपर और Polya साइट के बहाव दरार जटिल की भर्ती पर नियंत्रण. तुरंत दरार के बाद, पूर्व mRNAs परिपक्व स्थिर आरएनए संदेशों का उत्पादन करने के लिए Pólya पोलीमर्स (पीएपी) द्वारा polyadenylated रहे हैं.
एक शाही सेना प्रतिलेख के 3 'अंत के प्रसंस्करण विशिष्ट radiolabeled शाही सेना substrates के साथ सेलुलर परमाणु अर्क का उपयोग का अध्ययन किया जा सकता है. संक्षेप में, एक लंबे समय 32 </ Sup> पी लेबल uncleaved अग्रदूत आरएनए विट्रो में परमाणु निष्कर्षों के साथ incubated है, और दरार जेल वैद्युतकणसंचलन और autoradiography द्वारा मूल्यांकन किया है. उचित दरार होती है, जब '5 एक छोटी उत्पाद का पता चला और मात्रा निर्धारित है cleaved. यहाँ, हम एक उदाहरण के रूप में, का उपयोग कर विस्तार से एचआईवी -1 mRNAs का 3 'अंत प्रसंस्करण दरार परख का वर्णन.
Introduction
सबसे परिपक्व यूकेरियोटिक संदेश RNAs (mRNAs) के biosynthesis ऐसे कैपिंग, splicing और polyadenylation के रूप में कई बाद transcriptional संशोधनों की आवश्यकता है. इन संशोधनों को आम तौर पर सही प्रसंस्करण 1 सुनिश्चित करने और जोरदार mRNA की स्थिरता को बढ़ाने के लिए मिलकर कर रहे हैं.
3 'स्तनधारी पूर्व mRNAs का अंत गठन से 5 adenylate अवशेषों के अलावा द्वारा पीछा नवजात शाही सेना के endonucleolytic दरार से उत्पन्न होता है' पाली (ए) पोलीमर्स (पीएपी) 2-4 से उत्पाद cleaved. स्तनधारियों में, दरार विशिष्ट पूर्व शाही सेना दृश्यों पर assembles जो लगभग 800 केडीए, के, एक multicomponent प्रोटीन जटिल द्वारा पूरा किया है. पाली (ए) संकेत अनुक्रम, एक उच्च संरक्षित विहित hexanucleotide अनुक्रम AAUAAA, पर लगभग 10-30 NT नीचे की ओर दरार साइट निर्देशन. इस साइट में विशेष रूप से दरार और polyadenylation विशिष्टता कारक (CPSF) और 73 केडी सबयूनिट द्वारा मान्यता प्राप्त हैCSPF endonuclease गतिविधि में शामिल है. दरार उत्तेजना कारक (CstF) नीचे की ओर पाली (ए) साइट की एक अधिक पतित गुजरात या यू युक्त तत्व अनुक्रम बांधता है. इसके अलावा स्तनधारी दरार कारक मैं (CFIm), और स्तनधारी दरार कारक द्वितीय (CFII) दरार के लिए आवश्यक है. CFIm जीनों के एक नंबर के लिए परिभाषित और महत्वपूर्ण शारीरिक प्रक्रियाओं 5-8 में शामिल होने लगते किया गया है कि नदी के ऊपर अनुक्रम तत्वों (का उपयोग करता है) में विशिष्ट UGUA (एन) साइटों बांधता है.
इन विट्रो में, शाही सेना प्रसंस्करण प्रतिक्रियाओं आमतौर पर radiolabeled शाही सेना substrates 9-12 के उपयोग से विश्लेषण कर रहे हैं. ये जीवाणुभोजी प्रमोटर T7 या SP6 से रन ऑफ प्रतिलेखन द्वारा संश्लेषित किया जा सकता है. पहले विशेषता नहीं किया गया है कि एक polyadenylation साइट का अध्ययन करते हैं, यह महत्वपूर्ण अनुप्रवाह दृश्यों सीडीएनए में उपस्थित नहीं हो सकता है, के रूप में शाही सेना सब्सट्रेट उत्पन्न करने के लिए जीनोमिक डीएनए के बजाय सीडीएनए का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. कम से कम 150 NT upstrea शामिल करने के लिए डिजाइन substratesमीटर और 50 NT बहाव के परिपक्व mRNA पर दरार साइट / अंत से. दरार उत्पाद सब्सट्रेट की तुलना में तेजी प्रवास करती है; अन्य टुकड़े गैर विशिष्ट nuclease कार्रवाई से उत्पन्न हो सकता है क्योंकि हालांकि, प्रतिक्रिया की विशिष्टता सही प्रसंस्करण संकेत दृश्यों पर अपनी निर्भरता द्वारा सत्यापित किया जाना है. इसलिए, AAUAAA अनुक्रम (जैसे AAGAAA) में एक बिंदु उत्परिवर्तन के साथ शाही सेना substrates दरार प्रतिक्रिया के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं.
Radiolabeled शाही सेना की एक छोटी राशि दरार प्रतिक्रियाओं के लिए प्रयोग किया जाता है यह देखते हुए कि ज्यादातर परमाणु अर्क में उच्च बहुतायत में मौजूद RNases समस्याग्रस्त हो, और निकालने की तैयारी के लिए शुरू सामग्री के विकल्प सीमित कर सकते हैं. HELA कोशिकाओं अंतर्जात RNases के निम्न स्तर के होते हैं, और इस प्रकार इन assays में अच्छा प्रदर्शन करते हैं.
vivo में इन विट्रो में शाही सेना के substrates endonucleolytic दरार तुरंत पाली (ए) के अलावा, गुरु द्वारा पीछा किया जाता हैएस cleaved मध्यवर्ती detectable मात्रा में मौजूद नहीं है. इसलिए, एक विशिष्ट शाही सेना अनुक्रम या एक दरार प्रतिक्रिया में शामिल प्रोटीन या तो अध्ययन करने के लिए, प्रयोगों से होने वाली polyadenylation रोकने कि परिस्थितियों में किया जाता है. एक दरार प्रतिक्रिया को नुकसान पहुँचाने के बिना polyadenylation रोक सकता है तो कोई polyadenylation पर दरार की निर्भरता, या इसके विपरीत, वहाँ है. इस प्रकार, एटीपी केवल एक एकल nucleotide पाली (ए) साइट पर शामिल किया जा सकता है और सिर्फ cleaved आरएनए का पता लगाया जा सकता है कि इतनी 3 'हाइड्रॉक्सिल समूह का अभाव है कि एक श्रृंखला समाप्त एनालॉग साथ बदल दिया है.
जटिलता और परख के इस प्रकार की ख़ासियत के उच्च स्तर को देखते हुए, हम इन विट्रो में mRNA व्यापारियों की दरार / पाली (ए) मशीनरी द्वारा endonucleolytic दरार अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल का वर्णन. हम सक्षम परमाणु अर्क तैयार radiolabeled शाही सेना substrates उत्पन्न, दरार प्रतिक्रिया करते हैं, और परिणाम का विश्लेषण और व्याख्या करने के लिए कैसे का वर्णनआईएनजी उत्पादों. चित्रा 1 एक दरार परख के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एचआईवी -1 पूर्व mRNAs का 3 'अंत के लिए एन्कोडिंग सब्सट्रेट RNAs के एक उदाहरण से पता चलता है. एचआईवी आरएनए जीनोम की 3 'अंत पाली (ए) साइट, एक जी यू समृद्ध क्षेत्र, और सभी वायरल mRNA टेप 13 के कुशल परिपक्वता के लिए आवश्यक हैं का उपयोग करें जो तत्व के रूप में कई महत्वपूर्ण विनियामक दृश्यों से बना है . इस उदाहरण में हम इनपुट शाही सेना सब्सट्रेट 338 NT और दरार 237 पर NT होने की उम्मीद है. Polyadenylation होने की अनुमति दी गई थी, तो उत्पादों की एक धब्बा 237 और 437 NT के बीच मनाया जाएगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
हेला सेल परमाणु अर्क में या इन निष्कर्षों से fractionated दरार कारकों के साथ किए गए इन विट्रो पूर्व mRNA 3 'दरार प्रतिक्रिया,, कोर दरार कारकों और उनके मुख्य परिसरों 16-21 की पहचान के लिए सक्षम है. इन कारकों के स…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एसवी एनआईएच K22AI077353 और Landenberger फाउंडेशन से धन समर्थन के लिए आभारी है. के.आर. कृतज्ञता एनआईएच (5SC1GM083754) से धन स्वीकार करता है.
Materials
| 1L Celstir Flask | Wheaton | 356884 | Different sizes available |
| 4 Position Slow Speed Stirrer | VWR | 12621-076 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra x-15R with SX4500 Rotor | |
| Ultra Centrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor | |
| Table Top Centrifuge 5417R | Eppendorf | Refridgerated | |
| Thermomixer incubator | Eppendorf | ||
| 250ml Conicle Tubes | Corning | 430776 | |
| 50ml Conicle Tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Ultra-clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK Modified MEM | Lonza | 04-719Q | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas | F-0500-A | Heat inactivated |
| L-Glut:Pen:Strep | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Potassium Chloride | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | |
| 5M Sodium Chloride Solution | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0.5M Solution | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher | A702-500 | |
| cOmplete EDTA-Free Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit | Thermo Scientific | 66372 | MWCO 7000 0.5ml-3ml |
| 15ml Dounce Tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | Different sizes available |
| Expand High Fidelity PCR Kit | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | Y02256 | 10mM each nucleotide |
| MaxiScript SP6/T7 Kit | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5') G RNA Cap | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [alpha-32p]-250uCi | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| Gel loading buffer II | Ambion | 8546G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Urea | Fisher | BP169-212 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| Ammonium Acetate | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 Acrylamide:Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% Absolute Ethanol 200 Proof | Acros | 61509-0040 | |
| Acid Phenol-Chloroform | Ambion | 9720 | For RNA |
| Scintilation Fluid | Fisher | SX18-4 | |
| Rnase Inhibitor | Promega | N261B | |
| Poly (Vinyl alcohol) PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Creatine Phosphate | Calbiochem | 2380 | |
| 100mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| Adjustable Sequencing Unit | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| Binder Clips | Office Depot | 838-056 | |
| 20cmx42cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1SET |
| 20cmx22cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1SET |
| 20cmx42cm Aluminum Cooling Plates | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1EA |
| 0.4mmx22cm Spacers | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1SET |
| 0.4mmx42cm Spacers | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1SET |
| 8-well Comb | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1EA |
| 16-well Comb | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1EA |
| 32-well Comb | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1EA |
| Gel Repel Coating | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | or SGR-0101 for individual bottle |
| Gel Loading Tips | Rainin | GT-10-4 | 0.1-10uL |
| Sequencing PowerPac HV | Bio-Rad | PowerPac HV | 5000V/500mA/400W |
| Gel Dryer Model 583 | Bio-Rad | Model 583 | |
| Hydrotech Vacuum Pump for gel dryer | Bio-Rad | ||
| Glogos II Glow-in-the-dark Markers | Agilent | 420201 | |
| Film 8×10 | Midsci | BX810 | |
| Film 14×17 | Phenix | F-BX1417 | |
| Autoradiography Cassette | Fisher | FBCA 1417 | 8×10 size available |
References
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