Die Analyse der RNA-Prozessierung Reaktionen mit Handy Free Systems: 3 'Ende Spaltung von prä-mRNA-Substrate<em> In-vitro-</em
Summary
RNA-Polymerase II synthetisiert eine Vorläufer-RNA, die über das 3'-Ende der reifen mRNA erstreckt. Das Ende der reifen RNA cotranscriptionally über die Endonuklease-Aktivität der Spaltungskomplex erzeugt wird, an einer Stelle, die durch RNA-Sequenzen bestimmt. Hier haben wir detailliert die Methode, um Spaltungsreaktionen in vitro zu studieren.
Abstract
Das 3'-Ende von Säuger mRNAs nicht durch abrupte Abbruch der Transkription durch RNA-Polymerase II (RNPII) ausgebildet ist. Stattdessen synthetisiert RNPII Vorläufer-mRNA über das Ende des reifen RNAs, und ein aktiver Prozess, der Endonuklease-Aktivität wird an einer bestimmten Stelle erforderlich. Die Spaltung der Vorläufer-RNA tritt normalerweise 10-30 nt stromabwärts von der Konsens polyA-Stelle (AAUAAA), nachdem die CA-Dinukleotide. Proteine aus der Spaltungskomplex eine multifaktorielle Protein-Komplex von etwa 800 kDa, erfüllen diese spezifischen Nuklease-Aktivität. Spezifische RNA-Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts von der polyA-Stelle steuern die Einstellung der Spalt komplex. Unmittelbar nach der Spaltung werden prä-mRNAs durch die Poly-A-Polymerase (PAP) polyadenyliert zu produzieren stabile RNA-Nachrichten zu reifen.
Verarbeitung von dem 3'-Ende eines RNA-Transkripts können unter Verwendung von Zellkernextrakten mit spezifischen radioaktiv markierten RNA-Substrate untersucht. In Summe ein lang 32 </ Sup> P-markierten ungespaltenen Vorläufer RNA wird mit Kernextrakten in vitro inkubiert und Spaltung wird durch Gelelektrophorese und Autoradiographie untersucht. Wenn der richtig Spaltung auftritt, eine kürzere 5 'gespalten Produkt nachgewiesen und quantifiziert. Hier beschreiben wir die Spaltungstest im Detail, wobei als ein Beispiel, das den 3'-End-Verarbeitung von HIV-1 mRNAs.
Introduction
Die Biosynthese der meisten reifen eukaryotischen Nachricht RNAs (mRNAs) erfordert mehrere posttranskriptionale Modifikationen wie Capping, Spleißen und Polyadenylierung. Diese Modifikationen sind in der Regel gekoppelt ist, um eine korrekte Verarbeitung 1 zu gewährleisten und die Stabilität der mRNA stark erhöhen.
Das 3'-Ende die Bildung von Säuger-prä-mRNAs durch endonukleolytische Spaltung des entstehenden RNA, gefolgt von Zugabe der Adenylat-Reste an den 5 'erzeugt gespalten Produkt von Poly (A)-Polymerase (PAP) 2-4. Bei Säugetieren ist Spaltung durch ein Mehrkomponenten-Protein-Komplex durchgeführt, von etwa 800 kDa, die auf spezifische RNA-Sequenzen vor-montiert. Die Poly (A)-Signalsequenz, eine hoch konservierte kanonische Hexanukleotidsequenz AAUAAA, leitet die Spaltstelle bei etwa 10-30 nt stromabwärts. Diese Seite ist speziell von der Spaltung und Polyadenylierung Spezifität Faktor (CPSF) und dem 73 kD-Untereinheit der anerkanntenCSPF enthält die Endonukleaseaktivität. Die Spaltung Stimulationsfaktor (CstF) bindet eine degenerierte GU-oder U-reiche Element Sequenz stromabwärts des Poly (A)-Stelle. Erforderlich für die Spaltung der Spaltungssäugerfaktor I (cfim) und die Spaltung Säugerfaktor II (CFII). Cfim bindet die spezifischen UGUA (N)-Stellen in vor-Sequenzelemente (benutzt), die für eine Reihe von Genen, die definiert wurden, und scheint in wichtige physiologische Prozesse 5-8 einbezogen werden.
In vitro RNA-Prozessierung Reaktionen sind allgemein durch die Verwendung von radioaktiv markierten RNA-Substrate 9-12 analysiert. Diese können durch Run-off-Transkription aus dem Bakteriophagen T7-oder SP6-Promotors synthetisiert werden. Bei der Untersuchung eine Polyadenylierungsstelle, die vorher nicht charakterisiert worden ist, ist es notwendig, um genomische DNA, anstatt cDNA zu verwenden, um das RNA-Substrat zu erzeugen, wie wichtig stromabwärts gelegenen Sequenzen in cDNA vorhanden sein könnten. Design Substrate mindestens 150 nt upstrea umfassenm und 50 nt stromabwärts von der Spaltstelle / Ende auf der reifen mRNA. Das Spaltprodukt wandert schneller als das Substrat; da jedoch andere Fragmente können durch nicht-spezifische Nuklease Aktion erzeugt werden, weist die Spezifität der Reaktion durch die Abhängigkeit von der korrekten Bearbeitung Signalfolgen überprüft werden. Daher RNA-Substrate mit einer Punktmutation in der Sequenz AAUAAA (zB AAGAAA) dienen als negative Kontrolle für die Spaltungsreaktion.
Da eine geringe Menge radioaktiv markierten RNA wird für die Spaltungsreaktionen eingesetzt wird, kann in hoher Zahl in den meisten Kernextrakten RNasen problematisch sein, und die Wahl des Ausgangsmaterials für die Extraktzubereitung beschränken. HeLa-Zellen dazu neigen, niedrige endogene RNase enthalten, und somit in diesen Assays positiv.
Die endonukleolytische Spaltung von RNA-Substrate in vivo und in vitro sofort von der Poly (A)-Additions, Do gefolgts die gespaltene Zwischen ist nicht in nachweisbaren Mengen vorhanden. Deshalb, um entweder eine bestimmte RNA-Sequenz oder Proteinen in einer Spaltungsreaktion beteiligt studieren, Experimente unter Bedingungen, die die Polyadenylierung verhindern geführt. Es gibt keine Abhängigkeit der Spaltung auf die Polyadenylierung, oder umgekehrt, so kann man Polyadenylierung, ohne die Spaltungsreaktion zu stoppen. Somit wird ATP mit einem Kettenabbruch Analogon, das die 3'-Hydroxylgruppe fehlt, so daß nur ein einzelnes Nukleotid an der Poly (A)-Stelle eingebaut werden und nur gespalten RNA nachgewiesen werden kann ersetzt.
In Anbetracht der Komplexität und hohe Besonderheit dieser Art von Assay, beschreiben wir eine detaillierte Videoprotokoll zu endonukleolytische Spaltung durch die Spaltungs / Poly (A) mRNA-Maschinen-Vorstufen in vitro zu studieren. Wir beschreiben, wie die zuständigen Kernextrakte herzustellen, erzeugen radioaktiv markierten RNA-Substrate, führen die Spaltungsreaktion und analysieren und interpretieren Sie das Ergebnisten Produkte. Fig. 1 zeigt ein Beispiel eines Substrats RNAs kodiert für das 3'-Ende des HIV-1-prä-mRNAs für eine Spaltungsassay verwendet werden. Das 3'-Ende des HIV-RNA-Genom ist von vielen wichtigen regulatorischen Sequenzen wie die Poly (A)-Stelle, einem G + U-reiche Region, und die Verwendung Element, die alle für eine effiziente Reifung der viralen mRNA-Transkripte 13 notwendig sind zusammen . In diesem Beispiel würden wir erwarten, dass die Eingangs RNA-Substrat auf 338 nt und 237 nt bei der Spaltung sein. Wenn Polyadenylierung durfte auftreten, würde ein Abstrich von Produkten zwischen 237 und 437 nt beobachtet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in vitro-pre-mRNA 3 'Spaltungsreaktion, in HeLa-Zellkernextrakten oder mit Spaltung Faktoren aus diesen Extrakten fraktioniert durchgeführt wird, hat die Identifizierung der Kernspaltungsfaktoren und deren Hauptkomplexe 16-21 aktiviert. Viele weitere Proteine mit diesen Faktoren zugeordnet wurden kürzlich identifiziert 22 und der in-vitro-Reaktion kann weiterhin Licht auf, wie diese Proteine tragen zur Reaktion zu vergießen. Vielleicht weil die Reaktion …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SV ist dankbar für die finanzielle Unterstützung von der NIH K22AI077353 und der Landenberger-Stiftung. KR dankt Mittel aus dem NIH (5SC1GM083754).
Materials
| 1L Celstir Flask | Wheaton | 356884 | Different sizes available |
| 4 Position Slow Speed Stirrer | VWR | 12621-076 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra x-15R with SX4500 Rotor | |
| Ultra Centrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor | |
| Table Top Centrifuge 5417R | Eppendorf | Refridgerated | |
| Thermomixer incubator | Eppendorf | ||
| 250ml Conicle Tubes | Corning | 430776 | |
| 50ml Conicle Tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Ultra-clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK Modified MEM | Lonza | 04-719Q | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas | F-0500-A | Heat inactivated |
| L-Glut:Pen:Strep | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Potassium Chloride | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | |
| 5M Sodium Chloride Solution | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0.5M Solution | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher | A702-500 | |
| cOmplete EDTA-Free Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit | Thermo Scientific | 66372 | MWCO 7000 0.5ml-3ml |
| 15ml Dounce Tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | Different sizes available |
| Expand High Fidelity PCR Kit | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | Y02256 | 10mM each nucleotide |
| MaxiScript SP6/T7 Kit | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5') G RNA Cap | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [alpha-32p]-250uCi | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| Gel loading buffer II | Ambion | 8546G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Urea | Fisher | BP169-212 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| Ammonium Acetate | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 Acrylamide:Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% Absolute Ethanol 200 Proof | Acros | 61509-0040 | |
| Acid Phenol-Chloroform | Ambion | 9720 | For RNA |
| Scintilation Fluid | Fisher | SX18-4 | |
| Rnase Inhibitor | Promega | N261B | |
| Poly (Vinyl alcohol) PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Creatine Phosphate | Calbiochem | 2380 | |
| 100mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| Adjustable Sequencing Unit | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| Binder Clips | Office Depot | 838-056 | |
| 20cmx42cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1SET |
| 20cmx22cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1SET |
| 20cmx42cm Aluminum Cooling Plates | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1EA |
| 0.4mmx22cm Spacers | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1SET |
| 0.4mmx42cm Spacers | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1SET |
| 8-well Comb | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1EA |
| 16-well Comb | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1EA |
| 32-well Comb | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1EA |
| Gel Repel Coating | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | or SGR-0101 for individual bottle |
| Gel Loading Tips | Rainin | GT-10-4 | 0.1-10uL |
| Sequencing PowerPac HV | Bio-Rad | PowerPac HV | 5000V/500mA/400W |
| Gel Dryer Model 583 | Bio-Rad | Model 583 | |
| Hydrotech Vacuum Pump for gel dryer | Bio-Rad | ||
| Glogos II Glow-in-the-dark Markers | Agilent | 420201 | |
| Film 8×10 | Midsci | BX810 | |
| Film 14×17 | Phenix | F-BX1417 | |
| Autoradiography Cassette | Fisher | FBCA 1417 | 8×10 size available |
References
- Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
- Wahle, E., Ruegsegger, U. 3′-End processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).
- Colgan, D. F., Manley, J. L. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation. Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3′ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA biology. 9, 563-576 (2012).
- Danckwardt, S., et al. The prothrombin 3’end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations. Blood. 104, 428-435 (2004).
- Moreira, A., et al. The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3′ end formation by two distinct mechanisms. Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).
- Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2. Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).
- Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal. Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).
- Moore, C. L., Sharp, P. A. Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate. Cell. 41, 845-855 (1985).
- Gilmartin, G. M. . mRNA formation and function. , 79-98 (1997).
- Wahle, E., Keller, W. . RNA Processing. Vol. II. , 1-34 (1994).
- Chabot, B. . RNA Processing Vol I. 1, 1-29 (1994).
- Valente, S. T., et al. HIV-1 mRNA 3′ end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8. Mol Cell. 36, 279-289 (2009).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. 2′-Fluoro- and 2′-amino-2′-deoxynucleoside 5′-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. Biochimie. 31, 9636-9641 (1992).
- Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3′ processing signal AAUAAA. EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).
- Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. Four factors are required for 3′-end cleavage of pre-mRNAs. Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).
- Takagaki, Y., et al. A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs. Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).
- Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits. Mol Cell. 1, 243-253 (1998).
- Vries, H., et al. Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors. EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).
- Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing. Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3′ processing complex. Mol Cell. 33, 365-376 (2009).
- Bentley, D. L. Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).
- Tian, B., Manley, J. L. Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it. Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).
- Ryner, L. C., Manley, J. L. Requirements for accurate and efficient mRNA 3′ end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro. Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).
- Hirose, Y., Manley, J. L. Creatine phosphate, not ATP, is required for 3′ end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro. J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).
- Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. Small molecule activators of pre-mRNA 3′ cleavage. RNA. 15, 483-492 (2009).
