Analyse des réactions de transformation de l'ARN utilisant des cellules des systèmes gratuits: 3 'Fin de clivage de pré-ARNm substrats<em> In vitro</em
Summary
L'ARN polymérase II synthétise un ARN précurseur qui s'étend au-delà de l'extrémité 3 'de l'ARNm mature. L'extrémité de l'ARN mature est généré cotranscriptionally, sur un site dictée par des séquences d'ARN, par l'intermédiaire de l'activité d'endonucléase du complexe de clivage. Ici, nous détaillons la méthode d'étudier les réactions de clivage in vitro.
Abstract
L'extrémité 3 'des ARNm de mammifères n'est pas formé par un arrêt brutal de la transcription par l'ARN polymérase II (RNPII). Au lieu de cela, RNPII synthétise précurseur ARNm delà de la fin des ARN matures, et un processus actif de l'activité de l'endonucléase est nécessaire à un site spécifique. Le clivage de l'ARN précurseur se produit normalement 10 à 30 nt en aval du site polyA de consensus (AAUAAA) après les dinucléotides CA. Les protéines provenant du complexe de clivage, d'un complexe protéique multifactorielle d'environ 800 kDa, d'accomplir cette activité de nucléase spécifique. Des séquences d'ARN spécifiques en amont et en aval du site polyA contrôlent le recrutement du complexe de clivage. Immédiatement après le clivage, les pré-ARNm sont polyadénylés par la polymerase polyA (PAP) pour produire des messages d'ARN matures stables.
Le traitement de l'extrémité 3 'd'un transcrit d'ARN peut être étudiée en utilisant des extraits nucléaires cellulaires avec des substrats spécifiques d'ARN radiomarqués. En somme, un long 32 </ Sup> ARN précurseur non clivé P-marqué est incubé avec des extraits nucléaires in vitro, et clivage est évaluée par électrophorèse sur gel et autoradiographie. Lorsque clivage bon produit, un court 5 'clivé produit est détecté et quantifié. Ici, nous décrivons le test de clivage en détail à l'aide, par exemple, le traitement du VIH-1 ARNm extrémité 3 '.
Introduction
La biosynthèse de la plupart des ARN messages eucaryotes matures (ARNm) nécessite plusieurs modifications post-transcriptionnel comme le recouvrement, l'épissage et de polyadénylation. Ces modifications sont généralement couplés pour assurer un traitement correct et une augmenter fortement la stabilité de l'ARNm.
Le 3 'de la fin de la formation de pré-ARNm de mammifère est produite par le clivage endonucléolytique de l'ARN naissant suivie par l'addition de résidus adenylate à l'extrémité 5' produit clivé par poly (A) polymérase (PAP) 4.2. Chez les mammifères, le clivage est effectué par un complexe protéique à plusieurs composants, d'environ 800 kDa, qui se monte sur des séquences pré-ARN spécifiques. Le poly (A) de la séquence signal, une séquence AAUAAA hexanucléotidique canonique hautement conservée, dirige le site de coupure à environ 10 à 30 nt en aval. Ce site est spécifiquement reconnu par le facteur de clivage et de polyadénylation spécificité (FSP) et la sous-unité de 73 kD deCSPF contient l'activité d'endonucléase. Le facteur de stimulation de clivage (CstF) se lie à un plus dégénérée de la séquence d'élément GU-U ou riches en aval de l'ARN poly (A) Site. Également requis pour le clivage est le facteur de clivage de mammifère I (MCIF), et le facteur de clivage de mammifère II (CFII). CFIM lie les sites spécifiques UGUA (N) dans les éléments de la séquence amont (usages) qui ont été définis pour un certain nombre de gènes et semblent être impliqués dans des processus physiologiques importants 5-8.
In vitro, des réactions de transformation de l'ARN sont couramment analysées par l'utilisation de substrats d'ARN radiomarqués 9-12. Ceux-ci peuvent être synthétisés par ruissellement transcription à partir du promoteur du bactériophage T7 ou SP6. Lorsque l'on étudie un site de polyadénylation qui n'a pas été caractérisé plus tôt, il est nécessaire d'utiliser l'ADN génomique au lieu de l'ADNc pour produire le substrat d'ARN, comme des séquences en aval importantes risquent de ne pas être présents dans l'ADNc. Conception des substrats pour inclure au moins 150 nt upstream et 50 nt en aval du site de clivage / fin de l'ARNm mature. Le produit de clivage migre plus vite que le substrat; cependant, parce que d'autres fragments peuvent être générés par une action non spécifique nucléase, la spécificité de la réaction qui doit être vérifié par sa dépendance à l'égard des séquences de signaux de traitement correctes. Par conséquent, des substrats d'ARN avec une mutation ponctuelle dans la séquence AAUAAA (par exemple AAGAAA) servent de témoin négatif pour la réaction de clivage.
Étant donné qu'une petite quantité de l'ARN radiomarqué est utilisé pour les réactions de clivage, RNases présentes dans une grande abondance dans la plupart des extraits nucléaires peuvent être problématiques, et de limiter le choix de la matière de départ pour la préparation de l'extrait. Cellules HeLa ont tendance à contenir de faibles niveaux de RNases endogènes, et donc de bons résultats dans ces essais.
Le clivage endonucléolytique des substrats d'ARN in vivo et in vitro est immédiatement suivi par le poly (A) addition, jeu.s l'intermédiaire clivé est pas présente en quantités détectables. Par conséquent, pour étudier, soit une séquence d'ARN spécifique ou des protéines impliquées dans une réaction de clivage, des expériences sont effectuées dans des conditions qui empêchent l'apparition de polyadénylation. Il n'ya pas de dépendance de clivage sur polyadénylation, ou vice-versa, si on peut arrêter polyadénylation sans nuire à la réaction de clivage. Ainsi, l'ATP est remplacé par un analogue de terminaison de chaîne qui n'a pas un groupe hydroxyle 3 'de telle sorte que seulement un seul nucleotide peut être incorporé au niveau du site poly (A) ARN et juste clivé peut être détecté.
Etant donné la complexité et le degré élevé de spécificité de ce type de dosage, on décrit un protocole de vidéo détaillée d'étudier le clivage endonucléolytique par la machine clivage / Poly (A) des précurseurs d'ARNm in vitro. Nous décrivons comment préparer des extraits nucléaires compétentes, générer des substrats d'ARN radiomarqués, effectuer la réaction de clivage, et analyser et interpréter le résultatproduits ing. figure 1 montre un exemple d'ARN substrats codant pour l'extrémité 3 'de HIV-1 de pré-ARNm à être utilisé pour un test de clivage. L'extrémité 3 'du génome de l'ARN du VIH est composé de plusieurs séquences régulatrices importantes telles que le site poly (A), une région riche en G + U, et l'élément d'utilisation qui sont tous nécessaires à la maturation efficace des produits de transcription d'ARNm viraux 13 . Dans cet exemple, nous nous attendons à l'ARN substrat d'entrée à 338 nt et après clivage 237 nt. Si polyadénylation a été autorisé à se produire, un frottis de produits serait observée entre 237 et 437 nt.
Protocol
Representative Results
Discussion
La réaction de clivage de pré-ARNm en 3 'in vitro, réalisée dans des extraits nucléaires de cellules HeLa ou avec des facteurs de clivage fractionnés à partir de ces extraits, a permis d'identifier les principaux facteurs de clivage et de leurs principaux complexes 16-21. Beaucoup plus de protéines associées à ces facteurs ont été récemment identifié 22, et la réaction in vitro peuvent continuer à faire la lumière sur la façon dont ces protéines contribu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SV est reconnaissant de l'appui de financement du NIH K22AI077353 et la Fondation Landenberger. KR remercie financement du NIH (5SC1GM083754).
Materials
| 1L Celstir Flask | Wheaton | 356884 | Different sizes available |
| 4 Position Slow Speed Stirrer | VWR | 12621-076 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra x-15R with SX4500 Rotor | |
| Ultra Centrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor | |
| Table Top Centrifuge 5417R | Eppendorf | Refridgerated | |
| Thermomixer incubator | Eppendorf | ||
| 250ml Conicle Tubes | Corning | 430776 | |
| 50ml Conicle Tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Ultra-clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK Modified MEM | Lonza | 04-719Q | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas | F-0500-A | Heat inactivated |
| L-Glut:Pen:Strep | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Potassium Chloride | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | |
| 5M Sodium Chloride Solution | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0.5M Solution | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher | A702-500 | |
| cOmplete EDTA-Free Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit | Thermo Scientific | 66372 | MWCO 7000 0.5ml-3ml |
| 15ml Dounce Tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | Different sizes available |
| Expand High Fidelity PCR Kit | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | Y02256 | 10mM each nucleotide |
| MaxiScript SP6/T7 Kit | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5') G RNA Cap | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [alpha-32p]-250uCi | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| Gel loading buffer II | Ambion | 8546G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Urea | Fisher | BP169-212 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| Ammonium Acetate | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 Acrylamide:Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% Absolute Ethanol 200 Proof | Acros | 61509-0040 | |
| Acid Phenol-Chloroform | Ambion | 9720 | For RNA |
| Scintilation Fluid | Fisher | SX18-4 | |
| Rnase Inhibitor | Promega | N261B | |
| Poly (Vinyl alcohol) PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Creatine Phosphate | Calbiochem | 2380 | |
| 100mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| Adjustable Sequencing Unit | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| Binder Clips | Office Depot | 838-056 | |
| 20cmx42cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1SET |
| 20cmx22cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1SET |
| 20cmx42cm Aluminum Cooling Plates | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1EA |
| 0.4mmx22cm Spacers | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1SET |
| 0.4mmx42cm Spacers | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1SET |
| 8-well Comb | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1EA |
| 16-well Comb | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1EA |
| 32-well Comb | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1EA |
| Gel Repel Coating | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | or SGR-0101 for individual bottle |
| Gel Loading Tips | Rainin | GT-10-4 | 0.1-10uL |
| Sequencing PowerPac HV | Bio-Rad | PowerPac HV | 5000V/500mA/400W |
| Gel Dryer Model 583 | Bio-Rad | Model 583 | |
| Hydrotech Vacuum Pump for gel dryer | Bio-Rad | ||
| Glogos II Glow-in-the-dark Markers | Agilent | 420201 | |
| Film 8×10 | Midsci | BX810 | |
| Film 14×17 | Phenix | F-BX1417 | |
| Autoradiography Cassette | Fisher | FBCA 1417 | 8×10 size available |
References
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