ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 'סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים<em> במבחנה</em
Summary
RNA פולימראז II מסנתז RNA מבשר שמשתרע מעבר לקצה '3 של ה-mRNA הבוגרת. סוף RNA הבוגר מופק cotranscriptionally, באתר מוכתב על ידי רצפי הרנ"א, באמצעות פעילות endonuclease של מתחם המחשוף. הנה, אנחנו פירוט את השיטה ללמוד תגובות מחשוף במבחנה.
Abstract
סוף '3 של mRNAs היונקים לא נוצר על ידי הפסקה פתאומית של שעתוק על ידי RNA פולימראז II (RNPII). במקום זאת, RNPII מסנתז mRNA המבשר מעבר לסוף RNAs הבוגר, ותהליך פעיל של פעילות endonuclease נדרש באתר ספציפי. מחשוף של RNA המבשר בדרך כלל מתרחש 10-30 NT במורד הזרם מאתר הקונצנזוס הפולה (AAUAAA) לאחר dinucleotides קליפורניה. חלבונים ממתחם המחשוף, חלבון מורכב multifactorial של כ 800 kDa, להשיג פעילות nuclease הספציפית הזה. רצפי הרנ"א ספציפיים מעלה או במורדו של האתר הפולה לשלוט על הגיוס של מתחם המחשוף. מייד לאחר מחשוף, טרום mRNAs הם polyadenylated ידי פולימראז הפולה (PAP) כדי לייצר להבשיל הודעות RNA יציבים.
עיבוד של סוף '3 של תעתיק הרנ"א ניתן ללמוד באמצעות תמציות גרעיניות סלולריות עם מצעי RNA רדיואקטיבי ספציפיים. לסיכום, 32 ארוכים </ Sup> RNA מבשר uncleaved P-שכותרתו הודגרו עם תמציות גרעיניות במבחנה, ומחשוף נבחנים על ידי ג'ל אלקטרופורזה וautoradiography. כאשר מחשוף ראוי מתרחש, קצר יותר 5 'ביקע מוצר מזוהה וכימות. כאן, אנו מתארים assay המחשוף בפירוט משתמשים, כדוגמא, עיבוד הסוף '3 של HIV-1 mRNAs.
Introduction
ביוסינתזה של רוב RNAs הבוגר אוקריוטים הודעה (mRNAs) דורשת מספר שינויים לאחר תעתיק כגון מכסת, שחבור וpolyadenylation. שינויים אלה הם בדרך כלל בשילוב כדי להבטיח עיבוד נכון 1 ומאוד להגדיל את היציבות של mRNA.
3 'היווצרות סוף מראש mRNAs יונקים מופקת על ידי מחשוף endonucleolytic של RNA המתהווה אחריו תוספת של שאריות adenylate ל5' ביקע מוצר על ידי פולי פולימראז (א) (PAP) 2-4. ביונקים, מחשוף מושגת על ידי חלבון מורכב multicomponent, של כ 800 kDa, אשר מרכיב על רצפים מראש RNA ספציפיים. פולי () רצף אות, AAUAAA רצף hexanucleotide הקנונית השמור ביותר, מכוונים את אתר המחשוף בכ 10-30 NT במורד הזרם. אתר זה מוכר במיוחד על ידי גורם המחשוף וpolyadenylation הסגוליות (CPSF) ומקטע KD 73 שלCSPF מכיל את פעילות endonuclease. גורם גירוי המחשוף (CstF) נקשר יותר מנוון רצף אלמנט GU-U או עשיר במורד הזרם של פולי (א ') באתר. נדרשו גם למחשוף הוא גורם היונקים המחשוף אני (CFIm), וגורם היונקים המחשוף השני (CFII). CFIm נקשר אתרי UGUA (N) הספציפיים באלמנטים במעלה הזרם רצף (שימושים) שהוגדרו עבור מספר גנים ונראה שהם מעורבים בתהליכים פיסיולוגיים חשובים 5-8.
במבחנה, תגובות עיבוד RNA מנותחות בדרך כלל על ידי השימוש במצעי RNA רדיואקטיבי 9-12. אלה עשויים להיות מסונתזים על ידי שעתוק נגר מT7 אמרגן bacteriophage או SP6. כאשר לומדים אתר polyadenylation שלא אפיין בעבר, יש צורך להשתמש בהדנ"א הגנומי ולא cDNA כדי ליצור את מצע RNA, כרצפים במורד הזרם חשובים לא יכולים להיות נוכחים בcDNA. מצעי עיצוב לכלול לפחות 150 upstrea NTמ 'ו50 NT במורד הזרם מאתר המחשוף / סיום על mRNA הבוגר. מוצר המחשוף נודד מהר יותר מאשר המצע; עם זאת, בגלל שברים אחרים עלולים להיווצר על ידי פעולת nuclease שאינו ספציפית, את הספציפיות של התגובה צריכה להיות מאומתת על ידי תלותה ברצפי עיבוד אותות הנכונים. לכן, מצעי RNA עם מוטציה נקודתית ברצף AAUAAA (למשל AAGAAA) ישמשו כביקורת שלילית לתגובת המחשוף.
בהתחשב בעובדה שכמות קטנה של RNA רדיואקטיבי משמשת לתגובות המחשוף, RNases הווה בשפע הגבוה ביותר בתמציות הגרעיניות יכולה להיות בעייתית, ולהגביל את הבחירה של החומר המוצא להכנת תמצית. תאי הלה נוטים להכיל רמות נמוכות של RNases אנדוגני, ובכך לבצע גם במבחנים אלה.
מחשוף endonucleolytic של מצעי RNA in vivo ו במבחנה ומייד אחריו פולי (א) בנוסף לכך, ה 'ים ביניים ביקע אינם נוכחים בכמויות לזיהוי. לכן, כדי ללמוד או רצף RNA ספציפי או חלבונים מעורבים בתגובת מחשוף, ניסויים נעשים בתנאים המונעים polyadenylation התרחשות. אין תלות של מחשוף בpolyadenylation, או להיפך, ולכן אחד לא יכול לעצור polyadenylation מבלי לפגוע בתגובת המחשוף. לפיכך, ה-ATP מוחלפת אנלוגי שרשרת סיום שחסרת קבוצת הידרוקסיל '3, כך שרק נוקלאוטיד יחיד יכול להיות משולב באתר פולי () ורק RNA ביקע ניתן לאתרם.
בהתחשב במורכבות וברמה גבוהה של ייחוד של סוג זה של assay, אנו מתארים פרוטוקול וידאו מפורט ללמוד מחשוף endonucleolytic ידי מכונות מחשוף / midi () של מבשרי ה-mRNA במבחנה. אנו מתארים כיצד להכין תמציות גרעיניות המוסמכות, לייצר מצעי RNA רדיואקטיבי, לבצע את תגובת הביקוע, ולנתח ולפרש את התוצאהמוצרי ing. איור 1 מציג דוגמא של RNAs מצע קידוד לסוף '3 של HIV-1 מראש mRNAs לשמש לassay מחשוף. סוף '3 של הגנום RNA HIV מורכב מהרבה רצפים רגולטוריים חשובים כגון אתר פולי (א'), אזור עשיר G + U, ואת אלמנט שימוש, אשר כולם הכרחיות להתבגרות יעילה של תעתיקי mRNA הנגיפי 13 . בדוגמא זו שהיינו מצפה מצע RNA הקלט להיות 338 NT ועל מחשוף 237 NT. אם polyadenylation הורשה להתרחש, כתם של מוצרים יהיה נצפה בין 237 ו437 NT.
Protocol
Representative Results
Discussion
התגובה במבחנה 'מראש mRNA 3 מחשוף, שבוצעה בתמציות גרעיניות תא הלה או עם גורמי מחשוף מופרדים מתמציות אלה, אפשרה זיהוי של גורמי מחשוף הליבה והמכלולים העיקריים שלהם 16-21. לאחרונה חלבונים רבים יותר הקשורות לגורמים אלה זוהו 22, והתגובה במבחנה יכולה להמשי…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SV הוא אסירת תודה על התמיכה במימון K22AI077353 NIH וקרן Landenberger. KR מודה בתודה מימון מ-NIH (5SC1GM083754).
Materials
| 1L Celstir Flask | Wheaton | 356884 | Different sizes available |
| 4 Position Slow Speed Stirrer | VWR | 12621-076 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra x-15R with SX4500 Rotor | |
| Ultra Centrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor | |
| Table Top Centrifuge 5417R | Eppendorf | Refridgerated | |
| Thermomixer incubator | Eppendorf | ||
| 250ml Conicle Tubes | Corning | 430776 | |
| 50ml Conicle Tubes | BD Falcon | 352098 | |
| Ultra-clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| JOKLIK Modified MEM | Lonza | 04-719Q | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas | F-0500-A | Heat inactivated |
| L-Glut:Pen:Strep | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| 1M Tris-HCl pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Potassium Chloride | MP Biomedicals | 194844 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| DTT | Alexis Biomedicals | 280-001-G-010 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-4 | |
| 5M Sodium Chloride Solution | Mediatech | 46-032-CV | |
| EDTA 0.5M Solution | Sigma-Aldrich | E7889-100ml | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher | A702-500 | |
| cOmplete EDTA-Free Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit | Thermo Scientific | 66372 | MWCO 7000 0.5ml-3ml |
| 15ml Dounce Tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D9938-1SET | Different sizes available |
| Expand High Fidelity PCR Kit | Roche | 11 732 650 001 | |
| 10mM dNTP Mix | Invitrogen | Y02256 | 10mM each nucleotide |
| MaxiScript SP6/T7 Kit | Ambion | AM1322 | |
| m7G(5')ppp(5') G RNA Cap | New England Biolabs | S1404S | |
| Century Marker Template Plus | Ambion | AM7782 | |
| Easytides UTP [alpha-32p]-250uCi | Perkin Elmer | BLU507H250UC | |
| Gel loading buffer II | Ambion | 8546G | |
| DEPC treated water | Ambion | AM9906 | |
| 10x TAE | Fisher | BP13354 | |
| 10x TBE | Ameresco Life Sciences | 0658-4L | |
| 10x PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Urea | Fisher | BP169-212 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED | Fisher | BP150-20 | |
| Ammonium Acetate | Fisher | A637-500 | |
| 40% 19:1 Acrylamide:Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0144 | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | |
| 100% Absolute Ethanol 200 Proof | Acros | 61509-0040 | |
| Acid Phenol-Chloroform | Ambion | 9720 | For RNA |
| Scintilation Fluid | Fisher | SX18-4 | |
| Rnase Inhibitor | Promega | N261B | |
| Poly (Vinyl alcohol) PVA | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Creatine Phosphate | Calbiochem | 2380 | |
| 100mM dATP | Fisher | BP2560-4 | |
| SDS | Acros | 23042-5000 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| Adjustable Sequencing Unit | Sigma-Aldrich | Z351881-1EA | |
| Binder Clips | Office Depot | 838-056 | |
| 20cmx42cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z352543 | 1SET |
| 20cmx22cm glass plates | Sigma-Aldrich | Z35252-7 | 1SET |
| 20cmx42cm Aluminum Cooling Plates | Sigma-Aldrich | Z352667 | 1EA |
| 0.4mmx22cm Spacers | Sigma-Aldrich | Z35230-6 | 1SET |
| 0.4mmx42cm Spacers | Sigma-Aldrich | Z352314-1 | 1SET |
| 8-well Comb | Sigma-Aldrich | Z35195-4 | 1EA |
| 16-well Comb | Sigma-Aldrich | Z351962 | 1EA |
| 32-well Comb | Sigma-Aldrich | Z351970 | 1EA |
| Gel Repel Coating | C.B.S. Scientific | SGR-0401 | or SGR-0101 for individual bottle |
| Gel Loading Tips | Rainin | GT-10-4 | 0.1-10uL |
| Sequencing PowerPac HV | Bio-Rad | PowerPac HV | 5000V/500mA/400W |
| Gel Dryer Model 583 | Bio-Rad | Model 583 | |
| Hydrotech Vacuum Pump for gel dryer | Bio-Rad | ||
| Glogos II Glow-in-the-dark Markers | Agilent | 420201 | |
| Film 8×10 | Midsci | BX810 | |
| Film 14×17 | Phenix | F-BX1417 | |
| Autoradiography Cassette | Fisher | FBCA 1417 | 8×10 size available |
References
- Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
- Wahle, E., Ruegsegger, U. 3′-End processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).
- Colgan, D. F., Manley, J. L. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation. Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3′ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA biology. 9, 563-576 (2012).
- Danckwardt, S., et al. The prothrombin 3’end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations. Blood. 104, 428-435 (2004).
- Moreira, A., et al. The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3′ end formation by two distinct mechanisms. Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).
- Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2. Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).
- Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal. Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).
- Moore, C. L., Sharp, P. A. Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate. Cell. 41, 845-855 (1985).
- Gilmartin, G. M. . mRNA formation and function. , 79-98 (1997).
- Wahle, E., Keller, W. . RNA Processing. Vol. II. , 1-34 (1994).
- Chabot, B. . RNA Processing Vol I. 1, 1-29 (1994).
- Valente, S. T., et al. HIV-1 mRNA 3′ end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8. Mol Cell. 36, 279-289 (2009).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. 2′-Fluoro- and 2′-amino-2′-deoxynucleoside 5′-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. Biochimie. 31, 9636-9641 (1992).
- Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3′ processing signal AAUAAA. EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).
- Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. Four factors are required for 3′-end cleavage of pre-mRNAs. Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).
- Takagaki, Y., et al. A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs. Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).
- Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits. Mol Cell. 1, 243-253 (1998).
- Vries, H., et al. Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors. EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).
- Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing. Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3′ processing complex. Mol Cell. 33, 365-376 (2009).
- Bentley, D. L. Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).
- Tian, B., Manley, J. L. Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it. Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).
- Ryner, L. C., Manley, J. L. Requirements for accurate and efficient mRNA 3′ end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro. Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).
- Hirose, Y., Manley, J. L. Creatine phosphate, not ATP, is required for 3′ end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro. J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).
- Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. Small molecule activators of pre-mRNA 3′ cleavage. RNA. 15, 483-492 (2009).
