שלוש תרבות ממדית של תאי אפיתל החלב בקרום במרתף מחדש היא שיטה שימושית לשחזר את ארכיטקטורת vivo של השד השפיר, וכדי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד. חשוב מכך, מערכת זו יכולה להיות מיושמת ללמוד קרצינומות פולשני ברקמות אחרות.
קרצינומות שד פולשני הן קבוצה של גידולי אפיתל ממאירים מאופיינת בחדירה לרקמות סמוכות ונטייה לגרורות. משחק הגומלין של אותות בין תאים סרטניים והמיקרו שלהם השפעה חזקה על צמיחת סרטן השד והתנהגות 1 ביולוגית. עם זאת, רובם של אותות הבאים מהמטריצה תאית אבדו או את הרלוונטיות שלהם היא understudied כאשר תאים גדלים בשתי תרבות ממדית (2D) כשכבה. בשנים האחרונות, שלוש תרבות ממדים (3D) בקרום במרתף מחדש התפתחה כשיטת בחירה לשחזר את ארכיטקטורת הרקמה של תאים בשד שפירים וממאירים. תאים שגודלו ב3D לשמר את הרמזים החשובים מהמטריצה תאית ולספק לשעבר vivo 2,3 מערכת רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ראוי לציין, שיש ראיות הולכות ומצטברים מצביעים על כך שהתאים מתנהגים בצורה שונה כאשר גדלו ב3D לעומת 4 2D. תרבות 3Dניתן להשתמש ביעילות כאמצעי לבדל את הפנוטיפ הממאיר מפנוטיפ שפיר בשד ושבסיס האיתות התאית ומולקולרית מעורב 3. אחד מסימני ההיכר של תאי אפיתל השפירים הוא שהם מקוטבים כך שהציטופלסמה הפסגה היא לכיוון הלום וציטופלסמה הבסיסית נשענת על הקרום במרתף. קוטביות apico-הבסיסי הזה אבוד, בקרצינומות שד פולשני, המתאפיינים בחוסר ארגון והיווצרות anastomosing והסתעפות צינוריות שאקראי מחלחל stroma סביב סלולריים. הבדלים אלה בין histopathological בלוטה שפירה וקרצינומה פולשנית יכולים להיות מועתק ב3D 6,7. שימוש בקריאת פסקי המתאימים כמו לכמת את מבני acinar סיבוב בודדים, או דיפרנציאלי ביטוי של סמנים מולקולריים תוקף להתפשטות תאים, קוטביות ואפופטוזיס בשילוב עם טכניקות אחרות מולקולריות וביולוגיה של תא, תרבות 3Dדואר יכול לספק כלי חשוב כדי להבין טוב יותר את השינויים התאיים בשינוי ממאיר ומגדיר את האיתות אחראית.
שלוש תרבות ממדי (3D) של תאי אפיתל שד על קרום במרתף מחדש היא מערכת מודל חשובה ללמוד את הפנוטיפ המורכב והאיתות קשורה של שד נורמלי וסרטן השד 2,3. היחידה התפקודית של שד היא יחידת מסוף צינור lobular (TDLU) אשר מורכבת מצינור קטן שסניפים לacini. Acini הם מבנים מאורגנים מאוד, מורכב משתי שכבות תאים, תאי אפיתל וmyoepithelial, אשר מוקפות בקרום במרתף 5. התכונות הייחודיות ביותר של acini הנורמלי הן קיטוב סלולארי, קובץ מצורף לקרום במרתף המשמש כבסיס וקשר מיוחד תאי תאים. ארגון מורכב זו מופר בקרצינומות פולשנית. תרבויות 2D בשימוש נרחב, שבו תאים גדלים כמו monolayers, אל תאפשר להיווצרות של acini. לפיכך, תרבות monolayer חסרה במתן מערכת כדי ללכוד את מערכת היחסים המורכבות שבין תאי האפיתלבשד נורמלי והסרת הפיקוח שלהם בסרטן השד. תרבויות אפיתל monotypic תפקודיות של תאי שד פותחו במספר מעבדות 2,3. תרבות 3D כוללת את הצמיחה של תאי שד על Matrigel, שהוא תמצית solubilized שמקורם בתאי סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל והוא זמין באופן מסחרי. מצע 3D אחר כמו קולגן אני גם נמצא בשימוש. יכולים להיות מתורבת תאי השד ב-3D על ידי assay 3D המשובץ, שבו תאים בתרבית מוטבעת בMatrigel 2. לחלופין, יכולים להיות מתורבת תאים על ידי 3D על assay העליון, המכונים גם assay כיסוי 3D, אשר הוא עלות האפקטיבית כפי שהוא דורש נפח קטן יותר של Matrigel, ומאפשר ניטור זמן לשגות של הקמת מושבה על ידי הדמיה בניגוד שלב והוא אידיאלי באתר הדמיה 2 -3. 3D על assay העליון נעשה שימוש כדי להגדיר את המתאם בין פנוטיפ acinar ופרופיל ביטוי גני 7.
תרבות 3D ניתן effectivאיליי משמש להבחנה בין תאים נורמלים ושפירים מקרצינומה פולשנית. תאי שד נורמלים ושפירים בצורת צמיחה נעצרה מבנים מקוטבים עם לומן מוגדר היטב במרכז בMatrigel ואילו תאי קרצינומה פולשנית לגדול בשפע ואקראי ללא סליקה של לומן. E6/E7 הונצח תאים אנושיים אפיתל החלב וקו סלולרי MCF10A, שהוא קו סלולרי הונצח באופן ספונטני שבודד מחולה 36 שנה ישנה עם שינויי fibrocystic, שימש בהצלחה לשחזר את הפנוטיפ שפיר בשד ב3D 3,8 ושמש מערכת מודל ללמוד את התפקיד המדכא בשעור וגידול של מספר מולקולות 8,9. יכול להיות מהונדסים לתאים שפירים אלה כדי לתפעל גן (ים) של עניין על ידי ההקדמה של lentivirus / רטרווירוס. אם הגן (ים) של עניין הוא מדכאי סרטן, מציאה shRNA תיווך תוביל לשינוי ממאיר ואילו אם הגן של עניין הוא ביטוי יתר של אונקוגן בתאים שפיריםצריך להראות פנוטיפ ממאיר. בשני המקרים מבני acinar נוצרו ב3D יכולים ללכוד את השינוי הממאיר.
תאים בודדים שפירים מצופים ב3D להתחיל להתרבות וליצור סביב מבנים כדוריים. ביום 5-8 במצטבר כדורי זה של תאים להתמיין לשכבה המקיפה מקוטבת של תאים שנמצאת במגע עם Matrigel, ומסה פנימית של תאים פחות מקוטבים, אשר חוסר מגע עם Matrigel. בימים הקרובים 10-15 התאים הפנימיים יתחילו למות על ידי אפופטוזיס להרכיב לומן ברור. התאים הממאירים יגדלו באקראי לאבד את הקוטביות שלהם. תאים מאוד ממאירים בדרך כלל בצורת הסתעפות מבנים. הבדלים אלה בפנוטיפ יכולים להיות שנתפסו על ידי הדמיה בניגוד שלב זמן לשגות ועל ידי באתר immunostaining עם סמנים מולקולריים רלוונטיים. הסמנים הנפוצים ביותר הם אלפא 6 integrin, סמן קוטביות בסיסי, בשילוב עם סמן התפשטות phospho-היסטון 3 וapoptotסמן ic ביקע caspase-3. זו האחרונה היא חשובה כדי לקבוע אם יש היווצרות לומן במרכז acini, תכונה של תאי שד נורמלים ושפירים. סמני קוטביות וקשר תאי תאים אחרים כוללים GM130, laminin, ERM, E-cadherin. לחלופין יכולות להיות מהונדסות שורות תאי סרטן השד כדי לתפעל את הגן של עניין. במקרה הזה חזרה לצמיחה יותר נעצרה פנוטיפ השפיר יכול לשמש כהקריא להבחין בין פנוטיפ הסרטן.
גם תרבות 3D ניתן להשתמש בזהירות כדי להתוות את מסלולי האיתות מעורבים בשינוי ממאיר 10-11. שימוש שהוזכר לעיל לקרוא-outs, מעכבים תרופתיים, נוגדני חסימה או חלבונים רקומביננטיים יכול לשמש להיות להצביע באיתות המולקולרית המובילה לשינוי ממאיר. עם מאמצים מתמשכים ממעבדות שונות שניתן לחלץ התאים מ3D לבודד RNA וגם להכין lysates לimmunoblotting אימונוגלובולינnoprecipitation. אסטרטגיות אלה מתוארות בשלבים ובאופן מפורט בפרוטוקול.
שתארנו כאן התרבות תלת ממדים של תאי אפיתל שד על קרום במרתף מחדש ואת השימושיות של מערכת זו כדי להבדיל בין פנוטיפ שפיר בשד לעומת ממאיר. גם מערכת זו יכולה לשמש לתרבות סוגי תאים שונים מרקמות בלוטות אחרות וכבר דווחה כי שימשה בהצלחה לאפיתל ערמונית התרבות, אפיתל הסימפונות, ות…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01 CA107469, R01 CA125577, וU01CA154224 לCG Kleer, האוניברסיטה של סרטן מרכז התמיכה של מישיגן.
Growth Factor Reduced matrigel | BD biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
Lab-Tek glass chamber slides 2- well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular probes | Please look at molecular probes website | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientifics | MAB1378 | 1:00 dilution for IF |
Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:00 dilution for IF |
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientifics | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |