Três Culturas dimensionais: Uma ferramenta para o estudo normal Acináceo Arquitetura vs transformação maligna das células de mama
Summary
Três cultura tridimensional de células epiteliais mamárias de uma membrana basal reconstituída é um método útil para recapitular a arquitectura in vivo da mama benigna, e para diferenciar o fenótipo maligno do fenótipo da mama benigna. Importante, este sistema pode ser aplicado para estudar os carcinomas invasivos em outros tecidos.
Abstract
Carcinomas da mama invasivos são um grupo de tumores epiteliais malignos caracterizada pela invasão de tecidos adjacentes e propensão para metástase. A interação de sinais entre as células cancerosas e seu microambiente exerce uma poderosa influência sobre o crescimento do câncer de mama e comportamento biológico 1. No entanto, a maioria destes sinais a partir da matriz extracelular são perdidas ou a sua relevância é subinvestigada quando as células são cultivadas em cultura de duas dimensões (2D) como uma monocamada. Nos últimos anos, a cultura tridimensional (3D) com uma membrana basal reconstituída tem surgido como um método de escolha para recapitular a arquitectura dos tecidos de células mamárias benignas e malignas. As células cultivadas em 3D reter as pistas importantes da matriz extracelular e fornecem um sistema ex vivo 2,3 fisiologicamente relevante. De notar que há cada vez mais evidências sugerindo que as células se comportam de forma diferente quando cultivada em 3D, em comparação com 4 2D. Cultura 3Dpode ser eficazmente utilizada como um meio para diferenciar o fenótipo maligno do fenótipo benigna da mama e para cimentar a sinalização celular e molecular envolvida 3. Uma das características distintas de células epiteliais benignas é que eles são polarizados de modo a que o citoplasma é apical para o lúmen e o citoplasma basal repousa sobre a membrana basal. Esta polaridade apico-basal é perdida em carcinomas invasivos da mama, que são caracterizadas por desorganização celular e formação da anastomose e ramificação túbulos que esmo infiltrados do estroma circundante. Estas diferenças histopatológicas entre glândula benigna e carcinoma invasivo pode ser reproduzido em 6,7 3D. Usando os Read-outs apropriadas como a quantificação de estruturas individuais acinares redondos, ou a expressão diferencial de marcadores moleculares validados para a proliferação celular, a polaridade e a apoptose, em combinação com outras técnicas de biologia molecular e celular, cultur 3De pode fornecer uma ferramenta importante para compreender melhor as alterações celulares durante a transformação maligna e para delinear a sinalização responsável.
Introduction
Cultura tridimensional (3D) de células epiteliais de mama na membrana basal reconstituída é um importante sistema modelo para estudar o fenótipo complexo e sinalização associada da mama normal e câncer de mama 2,3. A unidade funcional de mama lobular é a unidade terminal de conduta (TDLU) que consiste de uma pequena conduta que se ramifica em ácinos. Os ácinos são estruturas altamente organizadas, compostas por duas camadas de células, células epiteliais e mioepiteliais, que estão rodeados por uma membrana basal 5. As características mais distintivas de ácinos normais são polarização celular, o apego à membrana basal subjacente e contatos célula-célula especializados. Essa organização complexa é interrompido em carcinomas invasivos. As culturas 2D amplamente utilizados, em que as células são crescidas como monocamadas, não permitem a formação de ácinos. Assim, a cultura em monocamada é falta de fornecimento de um sistema para capturar a intrincada relação entre as células epiteliaisem mama normal e sua desregulamentação em câncer de mama. Culturas epiteliais monotípicas funcionais de células da mama foram desenvolvidas em vários laboratórios de 2,3. Cultura 3D envolve o crescimento de células da mama em Matrigel, que é um extracto solubilizado derivado de Engelbreth-Holm-Swarm células de sarcoma de ratinho e está disponível comercialmente. Outros substratos 3D como o colágeno também são usados. As células da mama podem ser cultivadas em 3D pelo ensaio incorporado 3D, em que as células são cultivadas incorporado em Matrigel 2. Alternativamente, as células podem ser cultivadas por 3D em cima ensaio, também chamado de teste de sobreposição 3D, que é rentável, pois requer menor volume de Matrigel, e facilita o monitoramento do lapso de tempo de formação de colônias por imagem de contraste de fase e é ideal para imagens em situ 2 -3. O 3D no topo ensaio tem sido utilizado para definir a correlação entre o fenótipo acinar e do perfil de expressão do gene 7.
Cultura 3D pode ser effectively usado para distinguir células normais e benignos do carcinoma invasivo. Células mamárias normais e benignos formar crescimento preso estruturas polarizadas com um lúmen bem definidas no centro em Matrigel enquanto que as células de carcinoma invasivo crescer prolífica e ao acaso, sem compensação da luz. E6/E7 imortalizada de células epiteliais mamárias humanas e uma linha celular MCF10A, que é uma linha celular imortalizada espontaneamente, isolado a partir de uma paciente de 36 anos de idade com alterações fibrocística, têm sido utilizados com sucesso para recuperar o fenótipo benigna da mama em 3D 3,8 e serviram um sistema-modelo para estudar a função supressora de tumores oncogénicos e de várias moléculas de 8,9. Estas células benignas podem ser modificados para manipular a gene (s) de interesse com a introdução de lentivírus / retrovírus. Se o gene (s) de interesse é um supressor de tumor, knockdown shRNA mediada conduzirá a uma transformação maligna que, quando o gene de interesse é uma sobre-expressão de oncogenes em células benignasdeve mostrar um fenótipo maligno. Em ambos os casos, as estruturas acinares formados em 3D pode captar a transformação maligna.
Células individuais benignos banhado em 3D começam a proliferar e formar rodada estruturas esféricas. Por dia 5-8 agregado esférico de células irá diferenciar em uma camada circundante de células polarizadas que está em contacto com o Matrigel e uma massa interna de células polarizadas menos, que carecem de contacto com o Matrigel. Nos próximos 10-15 dias, as células interiores vão começar a morrer por apoptose formando um lúmen claro. As células malignas vai crescer desordenadamente perder sua polaridade. Células altamente malignas geralmente formar estruturas de ramificação. Estas diferenças no fenótipo pode ser capturada por tempo fase lapso de imagem contraste e por in situ imunomarcação com marcadores moleculares relevantes. Os marcadores mais vulgarmente utilizados são alfa 6-integrina, um marcador de polaridade basal, em associação com o marcador da proliferação de fosfo-histona 3 e o apoptotmarcador ic caspase-3. Esta última é importante para determinar se existe a formação de lumen no centro dos ácinos, uma característica de células normais e benignas da mama. Outros polaridade e de contato célula-célula marcadores incluem GM130, laminina, ERM, E-caderina. Alternativamente as linhas de células de cancro da mama podem ser modificados para manipular o gene de interesse. Neste caso, a reversão para um crescimento mais preso fenótipo benigno pode ser usado como um lido para distinguir do fenótipo do cancro.
Cultura 3D também pode ser usada com cautela para delinear as vias de sinalização envolvidas na transformação maligna 10-11. Usando o acima mencionado limite lidos, inibidores farmacológicos, os anticorpos de bloqueio ou proteínas recombinantes podem ser usadas se localizar na sinalização molecular conduzindo a uma transformação maligna. Com esforços contínuos de vários laboratórios, é possível extrair as células de 3D para isolar RNA e também preparar lisados por immunoblotting e imunizaçãonoprecipitation. Estas estratégias são descritas em um passo a passo e forma detalhada no protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos aqui a cultura tridimensional de células epiteliais mamárias de uma membrana basal reconstituída e a utilidade deste sistema para diferenciar entre versus maligna fenótipo benigna da mama. Este sistema também pode ser utilizado para cultura de diferentes tipos de células de outros tecidos glandulares e tem sido relatada como tendo sido utilizados com sucesso para a cultura epitelial da próstata, do epitélio brônquico, e as células epiteliais da tiróide, para citar alguns 12-14. A i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01 CA107469, CA125577 R01 e U01CA154224 para CG Kleer, a Universidade do Centro de Câncer de Apoio de Michigan.
Materials
| Growth Factor Reduced matrigel | BD biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2- well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientifics | MAB1378 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientifics | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
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