소뇌 축삭의 레이저 Nanosurgery<em> 생체</em
Summary
레이저 nanodissection 결합 이광자 이미징은, 세포 내 해상도 중추 신경계 퇴행성 및 재생 공정을 연구하는 유용한 도구이다. 이 프로토콜은, 라벨 이미지 및 생체 내에서 소뇌 피질에서 하나의 등반 섬유를 해부하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.
Introduction
기계적 손상, 독성 모욕 또는 신경 변성 질환으로 인한 절개 축삭은 보통 10-13 전지 본체에서 분리 축삭의 말단 부분의 변성에 의해 이어진다. 몇 가지 예외를 제외하고 2,7,14,15로, 성인 동물의 CNS에서 절단 축삭은 일반적으로 재성장 프로그램 (16)을 활성화 할 수 없습니다.
약간은 세포와 세포 이하의 수준에서 퇴행성 이벤트의 실시간 역학에 대한 알려져있다. 신경 세포의 손상을 제한하고 신경 세포의 재성장을 촉진하기위한 새로운 전략의 개발은 단독으로 부상당한 신경 세포가 퇴화하고 재생하는 메커니즘을 명확히, 첫 번째 단계로,이 필요합니다. 이 연구는 가장 직접적으로 생체 내에서 단일 신경 세포의 역학을 모니터링하여 해결됩니다. 일 광자 형광 이미징 기술은 가시광의 산란 강도에 의해 제한되는 반면, 두 개의 광자 여기가 리 깊은 피질 층에 도달세포 내 해상도 3,4,17와 마우스를했습니다. 형광 단백질을 선택적으로 신경 18-20의 모집단에서 발현되는 형질 전환 마우스의 활용, TPF 현미경은 생체 내 21, 22의 개발 과정에서 시냅스 가소성과 축삭 신장의 탐사에 적용되었습니다. 유일하게 손상된 신경 세포의 T 그 기능에 부상이 특히 관심의 축삭을 대상으로 상해의 모델 두 광자 이미징에 의해 생체 모니터링에 커플 링에 의해 조사 할 수 있습니다 후 다시 자라게. 펨토초 펄스의 다 광자 흡수는 하나의 수상 돌기 또는 한 쪽이 5,23을 방해하는 데 사용되었습니다. 또한,이 부상 패러다임은 연락 덴 드라이트 (dendrite) 6을 방해하지 않고 하나의 축삭 가지를 절단 할 수 있습니다. 한 번 손상, 소뇌 등산 섬유 (CFS) 자신의 축삭을 재생하는 특정 신경 세포의 인구 수 있도록 기능을 해부의 컨텍스트 내에서 유용한 모델 SI는후부 그들은 심지어 성인 동물 (24, 25)의 부상 후 뛰어난 플라스틱의 특성을 유지합니다. 최근 CF 및 장기 이미징은 이러한 축삭 레이저 axotomy 6에 따라 일 재성장 할 수 있다는 것을 보여 주었다.
이 프로토콜은 선행 성 추적을 통해 olivocerebellar 뉴런과 자신의 축삭 신장 레이블을하는 방법에 대해 설명합니다. 관심의 신경 세포가 형광 표지되면, 그들은 두개골 창 아래에 몇 주 또는 몇 달 임의의 시점에서 반복적으로 모니터링 할 수 있습니다. 생체 내에서 레이저 axotomy에 의해 하나의 축삭 가지를 해부하는 절차는 설명한다.
여기에 제시된 기술은 생체 내에서 축삭 리모델링의 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공하고 신경 세포의 변성을 제한하고 축삭 재성장을 촉진하는 치료 전략의 개발을하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 형광 염료와 하부 올리브의 뉴런 레이블을하는 방법을 보여줍니다. 이어서, 소뇌 피질에 두개 창을 수행하는 방법을 설명한다. 이 기술은 olivocerebellar 신경, 등산 섬유의 단자 부분에 광 액세스를 제공합니다. 불행하게도, 라벨 및 개두 수술 모두의 결과는 (일반적으로 3 마우스 중 1 표시, 1 3 중 두개골 창 1 ~ 2 주 후에 명확 유지됩니다)도 숙련 된 운영자의 손에 아주 낮다.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission’s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the “Stem Cells Call for Proposals.” This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by “Ente Cassa di Risparmio di Firenze”.
Materials
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, haemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
References
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