Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em> In Vivo</em
Summary
Lazer nanodissection bağlanmış iki foton görüntüleme, hücre içi çözünürlük ile merkezi sinir sisteminin dejeneratif ve rejeneratif işlemlerini incelemek için yararlı araçlardır. Bu protokol, etiket görüntü ve in vivo serebellar korteks bir tırmanma lifleri incelemek için gösterilmiştir.
Abstract
Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.
Introduction
Mekanik yaralanma, zehirli hakaret ya da nörodejeneratif hastalıklara bağlı aksonal transseksiyon genellikle hücre gövdesi 10-13 ayrılır akson distal kısmının dejenerasyonu tarafından takip edilir. Birkaç istisna dışında 2,7,14,15 ile, yetişkin hayvanların MSS kopmuş aksonlar genellikle büyütme programı 16 aktive edemiyoruz.
Küçük, hücresel düzeyde dejeneratif olayların gerçek-zamanlı dinamikleri hakkında bilinmektedir. Nöronal hasarı sınırlama ve sinir hücrelerinin yeniden büyümesini teşvik için yeni stratejilerin geliştirilmesi singularly yaralı nöronal hücreleri ölür ve yeniden hangi mekanizmasını açıklığa kavuşturulması, bir ilk adım olarak, gerektirir. Bu çalışma, en doğrudan in vivo tek bir nöronun dinamiklerinin görüntülenmesi tarafından ele alınmaktadır. Bir foton flüoresan görüntüleme teknikleri görünür ışık yoğun bir saçılma ile sınırlı olsa da, iki foton uyarma li derin kortikal katmanları ulaşırsubsellüler çözünürlük 3,4,17 ile fareler ettik. Floresan proteinleri selektif nöron 18-20 alt grupları olarak ifade edildiği transjenik farelerin yararlanarak, TPF mikroskopi vivo 21,22 gelişme sırasında sinaptik plastisite ve aksonal uzama keşif uygulanmıştır. Tek başına hasar görmüş sinir hücrelerinin T o yeteneği için yaralanma özellikle ilgi akson hedefleyen yaralanma modeli ile iki foton görüntüleme ile vivo izleme bağlantısı ile incelenebilir sonra tekrar kavuştu. Femtosecond palslarının çoklu foton emme tek dendrit ya da tek dikenler 5,23 bozmak için kullanılmıştır. Ayrıca, bu yaralanma paradigma temas dendrit 6 aksatmadan tek akson dalları kesme sağlar. Kez hasar, serebellar tırmanma lifler (CFS) aksonları yeniden belirli nöronal nüfusu izin özellikleri diseksiyon kapsamında yararlı bir model si vardırnce onlar bile yetişkin hayvanlarda 24,25 yaralanmadan sonra olağanüstü plastik özelliklerini korurlar. Son zamanlarda, CFS uzun süreli görüntüleme bu aksonlar lazer axotomy 6 takip günlerde regrowing yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir.
Bu protokol anterograde izlemesi ile olivocerebellar nöronlar ve bunların akson uzamasını etiketlemek için nasıl açıklar. Ilgi konusu nöronlar floresan etiketli sonra, bir kafatası pencerenin altında hafta veya ay boyunca rasgele zaman noktalarında tekrar tekrar izlenebilir. In vivo lazer axotomy tarafından tek akson dalları incelemek için prosedürü daha sonra açıklanacaktır.
Burada sunulan teknikler in vivo aksonal yeniden mekanizması yeni bakış açıları ve nöronal dejenerasyonu sınırlamak ve akson büyümesini teşvik etmek için tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, bir floresan boya ile alt zeytinin nöronlar etiket gösterilmiştir. Daha sonra, serebellar korteks üzerinde bir kafatası pencere yapmak için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu teknik olivocerebellar nöronlar, tırmanma liflerin terminal kısmı için optik erişim sağlamaktadır. Ne yazık ki, etiketleme ve kraniotomi cerrahi hem de sonucu (genellikle 3 farelerin üzerinden 1 etiketli ve 1 out of 3 kafatası pencereleri 1-2 hafta sonra açık kalır) bile vasıflı operatörler elinde oldukça düş?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission’s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the “Stem Cells Call for Proposals.” This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by “Ente Cassa di Risparmio di Firenze”.
Materials
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, haemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
References
- Strata, P., Rossi, F. Plasticity of the olivocerebellar pathway. Trends Neurosci. 21, 407-413 (1998).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Prog Neurobiol. 72, 373-398 (2004).
- Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2, 932-940 (2005).
- Sacconi, L., et al. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Allegra Mascaro, A. L., et al. In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr Biol. 19, 930-936 (2009).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Canty, A. J., et al. Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex. J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Hilliard, M. A. Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war. J Neurochem. 108, 23-32 (2009).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Luo, L., O’Leary, D. D. Axon retraction and degeneration in development and disease. Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).
- Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons. Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).
- Morrison, E. E., Costanzo, R. M. Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system. Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).
- Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity. Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks. Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49, 861-875 (2006).
- Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F. Multi-photon nanosurgery in live brain. Frontiers in neuroenergetics. 2, 21 (2010).
- Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells. The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Progress in neurobiology. 72, 373-398 (2004).
- Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43. PLoS One. 6, e20791 (2011).
- Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum. Neuron. 56, 472-487 (2007).
- Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex. Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).
- Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum. Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (12), (2008).
