लेजर nanodissection के लिए युग्मित दो photon इमेजिंग, subcellular संकल्प के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में अपक्षयी और पुनर्योजी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं. इस प्रोटोकॉल लेबल छवि, और इन विवो में अनुमस्तिष्क प्रांतस्था में एकल चढ़ाई फाइबर काटना कैसे पता चलता है.
Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.
यांत्रिक चोट, विषाक्त अपमान या neurodegenerative रोगों से उत्पन्न axonal transection आमतौर पर सेल शरीर 10-13 से अलग है कि अक्षतंतु के बाहर का हिस्सा के पतन के बाद है. कुछ अपवादों 2,7,14,15 के साथ, वयस्क जानवरों की सीएनएस में कटे axons आमतौर पर एक regrowth कार्यक्रम 16 को सक्रिय करने में असमर्थ हैं.
लिटिल सेलुलर और subcellular स्तर पर अपक्षयी घटनाओं के वास्तविक समय की गतिशीलता के बारे में जाना जाता है. neuronal नुकसान को सीमित करने और neuronal regrowth को बढ़ावा देने के लिए नई रणनीति का विकास अकेले घायल neuronal कोशिकाओं पतित और पुनर्जन्म व्यवस्था है जिसके द्वारा स्पष्ट, पहले कदम के रूप में, की आवश्यकता है. इस अध्ययन में यह सबसे सीधे vivo में एक न्यूरॉन की गतिशीलता की निगरानी के द्वारा संबोधित किया है. एक फोटान प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक दृश्य प्रकाश की तीव्र बिखरने द्वारा सीमित हैं, वहीं दो photon उत्तेजना ली में गहरी cortical परतों तक पहुँचता हैsubcellular संकल्प 3,4,17 साथ चूहों लिया. फ्लोरोसेंट प्रोटीन चुनिंदा न्यूरॉन्स 18-20 की subpopulations में व्यक्त कर रहे हैं जिसमें ट्रांसजेनिक चूहों का लाभ उठाते हुए, TPF माइक्रोस्कोपी विवो 21,22 में विकास के दौरान synaptic plasticity और axonal बढ़ाव का अन्वेषण करने के लिए लागू किया गया है. अकेले क्षतिग्रस्त न्यूरॉन्स की टी वह क्षमता को चोट विशेष रूप से ब्याज की अक्षतंतु को लक्षित चोट की एक मॉडल के साथ दो photon इमेजिंग द्वारा vivo निगरानी में युग्मन द्वारा जांच किया जा सकता है के बाद regrow. Femtosecond दालों की मल्टी फोटॉन अवशोषण एकल डेन्ड्राइट या यहां तक कि एक कांटा 5,23 को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसके अलावा, इस चोट प्रतिमान से संपर्क डेन्ड्राइट 6 में खलल न डालें बिना एकल axonal शाखाओं को काटने की अनुमति देता है. एक बार क्षतिग्रस्त, अनुमस्तिष्क चढ़ाई फाइबर (सीएफएस) उनके axons पुनर्जीवित करने के लिए विशिष्ट neuronal आबादी की अनुमति है कि सुविधाओं विदारक के संदर्भ में एक उपयोगी मॉडल सी हैंnce वे भी वयस्क जानवरों 24,25 में चोट के बाद उल्लेखनीय प्लास्टिक गुण बरकरार रहती है. हाल ही में, सीएफएस के दीर्घकालिक इमेजिंग इन axons लेजर axotomy 6 पालन कि दिन में regrowing में सक्षम हैं कि पता चला है.
इस प्रोटोकॉल अग्रगामी ट्रेसिंग के माध्यम से olivocerebellar न्यूरॉन्स और उनके axonal बढ़ाव लेबल करने के लिए कैसे करें. ब्याज की न्यूरॉन्स fluorescently लेबल रहे हैं, वे एक कपाल खिड़की के नीचे हफ्तों या महीनों के लिए मनमाने ढंग से समय बिंदुओं पर बार बार नजर रखी जा सकती है. विवो में लेजर axotomy द्वारा एकल axonal शाखाओं काटना प्रक्रिया तो यह साफ हो जाएगा.
यहाँ प्रस्तुत तकनीक विवो में axonal remodeling के तंत्र में नए अंतर्दृष्टि प्रदान और neuronal अध: पतन की सीमा और axonal regrowth को बढ़ावा देने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में मदद कर सकते हैं.
इस प्रोटोकॉल एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ अवर जैतून के न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए कैसे दिखाता है. बाद में, अनुमस्तिष्क प्रांतस्था पर एक कपाल खिड़की प्रदर्शन करने की विधि का वर्णन किया है. इस तकनीक olivocerebellar न्?…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission’s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the “Stem Cells Call for Proposals.” This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by “Ente Cassa di Risparmio di Firenze”.
Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
Spongostan, haemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |