Laser nanosurgery av lillehjernen Axoner<em> I Vivo</em
Summary
To-foton bildebehandling, koblet til laser nanodissection, er nyttige verktøy for å studere degenerative og regenerative prosesser i sentralnervesystemet med subcellulære oppløsning. Denne protokollen viser hvordan du kan merke, image, og dissekere enkle klatrefibre i lillehjernen cortex in vivo.
Abstract
Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.
Introduction
Aksonal tran følge av mekanisk skade, giftige fornærmelse eller nevrodegenerative sykdommer er vanligvis etterfulgt av degenerasjon av distal del av aksonet som er løsrevet fra cellekroppen 10-13. Med noen få unntak 2,7,14,15, avkuttede axoner i CNS av voksne dyr er vanligvis ikke i stand til å aktivere en gjenvekst program 16.
Lite er kjent om de sanntid dynamikken i degenerative hendelser på cellulært og subcellulære nivå. Utviklingen av nye strategier for å begrense neuronskade og fremme neuronal gjenvekst krever, som et første skritt, avklare den mekanismen som særdeles skadde nerveceller utarte og regenerere. Denne studien er mest direkte adressert ved å overvåke dynamikken i en enkelt nervecelle i vivo. Mens ett foton fluorescens bildeteknikker er begrenset av intense spredning av synlig lys, når to-foton-eksitasjon dype kortikale lag i live mus med subcellulære oppløsning 3,4,17. Benytte seg av transgene mus der fluorescerende proteiner er selektivt uttrykt i subpopulasjoner av nevroner 18-20, har TPF mikros blitt brukt til utforskning av synaptisk plastisitet og aksonal forlengelse under utvikling in vivo 21,22. T han evnen til bemerkelsesverdig ødelagte nerveceller til gjenvekst etter skade kan undersøkes ved kobling in vivo overvåking av to-foton bildebehandling med en modell av skade spesielt rettet mot axon av interesse. Multi-fotonabsorpsjon av femtosecond pulser har blitt brukt til å forstyrre enkelt dendritter eller enkelt pigger 5,23. Videre tillater denne skaden paradigmet kutte enkelt aksonale grener uten å forstyrre kontakte dendrite seks. Innenfor rammen av dissekere de funksjoner som lar spesifikke nevronale befolkningen til å regenerere sine axoner en gang skadet, lillehjernen klatrefibre (CFS) er en nyttig modell since de beholder bemerkelsesverdige plastiske egenskaper etter skade selv i voksne dyr 24,25. Nylig, langsiktig avbildning av CFer viste at disse axons er i stand til etterveksten i dagene som følger laser axotomy seks.
Denne protokollen beskriver hvordan å merke olivocerebellar nevroner og deres axonal forlengelse gjennom antero sporing. Når neuronene av interesse er fluorescensmerkede, kan de bli overvåket gjentatte ganger ved vilkårlige tidspunkter i flere uker eller måneder i henhold til en cranial vindu. Fremgangsmåten for å dissekere enkelt aksonale grener av laser axotomy in vivo vil da bli vist.
Teknikkene som presenteres her gir ny innsikt i mekanismen av aksonal ombygging in vivo og kan bidra til utvikling av terapeutiske strategier for å begrense neuronal degenerasjon og fremme aksonal gjenvekst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen viser hvordan å merke nevroner av mindreverdig oliven med et fluorescerende fargestoff. Deretter er fremgangsmåten for å utføre en cranial vindu på lillehjernen cortex beskrevet. Denne teknikken gir optisk adgang til terminaldelen av olivocerebellar nevroner, klatring fibre. Dessverre er resultatet av både merking og kraniotomi kirurgi ganske lav, selv i hendene på dyktige operatører (vanligvis en av tre mus er merket, og en av tre kranie vinduer er fortsatt klart etter 1-2 uker).
<p class=…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission’s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the “Stem Cells Call for Proposals.” This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by “Ente Cassa di Risparmio di Firenze”.
Materials
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, haemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
References
- Strata, P., Rossi, F. Plasticity of the olivocerebellar pathway. Trends Neurosci. 21, 407-413 (1998).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Prog Neurobiol. 72, 373-398 (2004).
- Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2, 932-940 (2005).
- Sacconi, L., et al. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Allegra Mascaro, A. L., et al. In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr Biol. 19, 930-936 (2009).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Canty, A. J., et al. Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex. J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Hilliard, M. A. Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war. J Neurochem. 108, 23-32 (2009).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Luo, L., O’Leary, D. D. Axon retraction and degeneration in development and disease. Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).
- Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons. Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).
- Morrison, E. E., Costanzo, R. M. Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system. Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).
- Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity. Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks. Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49, 861-875 (2006).
- Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F. Multi-photon nanosurgery in live brain. Frontiers in neuroenergetics. 2, 21 (2010).
- Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells. The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Progress in neurobiology. 72, 373-398 (2004).
- Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43. PLoS One. 6, e20791 (2011).
- Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum. Neuron. 56, 472-487 (2007).
- Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex. Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).
- Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum. Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (12), (2008).
