Isolation des petits ARN non codant de sérum humain
Summary
Ce protocole décrit un procédé d'extraction de petits ARN à partir de sérum humain. Nous avons utilisé cette méthode pour isoler les micro-ARN à partir de sérum de cancer destiné à être utilisé dans les puces à ADN et PCR quantitative singleplex également. Le protocole utilise le phénol et du thiocyanate de guanidinium réactifs avec des modifications pour donner l'ARN de haute qualité.
Abstract
L'analyse de l'ARN et son expression est une caractéristique commune à de nombreux laboratoires. D'importance est l'émergence de petits ARN comme les microARN, qui se trouvent dans les cellules de mammifères. Ces petits ARN sont des régulateurs de gènes puissants de contrôle des canaux vitaux tels que la croissance, le développement et la mort et beaucoup d'intérêt a été réalisé à leur expression dans les fluides corporels. Ceci est dû à leur dérégulation dans les maladies humaines telles que le cancer et leur application possible en tant que biomarqueurs sériques. Cependant, l'analyse de l'expression des miARN dans le sérum peut être problématique. Dans la plupart des cas, la quantité de sérum est de limiter et de sérum contient de faibles quantités d'ARN total, dont de petits ARN constituent seulement 0,4-0,5% 1. Ainsi l'isolement de quantités suffisantes d'ARN de qualité à partir de sérum est un défi majeur pour les chercheurs d'aujourd'hui. Dans ce document technique, nous démontrons une méthode qui utilise seulement 400 pi de sérum humain pour obtenir l'ARN est suffisante pour soit des puces à ADN ou analyse qPCR. L'unvantages de ce procédé sont sa simplicité et sa capacité à produire de l'ARN de haute qualité. Il ne nécessite pas de colonnes spécialisées pour la purification de petits ARN et utilise des réactifs généraux et du matériel trouvés dans des laboratoires communs. Notre procédé utilise un gel de verrouillage de phase pour éliminer la contamination de phénol tout en donnant en même temps l'ARN de haute qualité. Nous introduisons également une étape supplémentaire pour éliminer encore tous les contaminants lors de l'étape d'isolement. Ce protocole est très efficace pour isoler l'ARN total des rendements allant jusqu'à 100 ng / ul de sérum, mais peut également être adapté à d'autres tissus biologiques.
Introduction
Au cours des dernières années, il ya eu une poussée de plus en plus de découvrir de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce des maladies humaines. Beaucoup d'attention a été porté sur l'utilisation de petits ARN tels que les microARN 2 (miARN ou mirs) comme marqueurs potentiels. Ces petits ARN sont trouvés dans les fluides corporels tels que le sérum, et des études ont montré qu'ils sont résistants à la dégradation et sont stables dans une gamme de conditions environnementales variables 3. Compte tenu de ces caractéristiques miARN, de sérum ou de circulation sont le biomarqueur idéal 4, 5. Actuellement, il existe deux approches principales pour l'isolement de petits ARN à partir de fluides biologiques. La première approche utilise une technologie basée sur les colonnes de lier et éluer les petits ARN 6, tandis que la seconde approche utilise le protocole de longue date avec le phénol et guanidinium thiocyanate réactifs 7. Nous avons développé un protocole simple, efficace, sans colonne pour isoler de petits ARN à partir de sérum humain. L'ARN isolé est immédiatementment utilisable dans des applications en aval, y compris les tableaux ADN d'oligonucléotides et le séquençage de l'ARN.
Ce protocole a été développé parce que nous avons été confrontés à plusieurs problèmes lors de l'utilisation des méthodes à base de phénol pour isoler l'ARN à partir de sérum. L'approche traditionnelle Chomczynski est fréquemment utilisé dans la plupart des laboratoires avec une gamme de réactifs disponibles dans la plupart des fournisseurs commerciaux. Toutefois, compte tenu de leur utilisation généralisée, les lignes directrices strictes n'ont pas été développées pour produire toujours ARN de haute qualité à partir de fluides corporels, dans le sang ou le sérum particulier.
Les problèmes courants associés à l'isolement d'ARN à partir de sérum d'ARN comprennent des rendements faibles et une contamination par des réactifs utilisés au cours de l'isolement, en particulier le phénol. Notre approche élimine ces impuretés phénoliques pour fournir de l'ARN de haute qualité pour analyse en aval telles que la PCR quantitative (qPCR) et le séquençage de l'ARN. Nous avons également testé cet ARN sur les tableaux de miARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
La population de microARN représente environ 0,4-0,5% de l'ARN total dans le sérum. En outre il existe également une teneur élevée en protéine présente dans le sérum humain. Pour améliorer l'ARN et de réduire à la fois la protéine et le phénol contamine nous avons modifié l'approche traditionnelle Chomczynski 9 avec l'ajout de plusieurs étapes.
L'ARN total a été isolé à partir de sérum en utilisant la norme Tri-Reagent RT-LS (Centre de reche…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Samantha Khoury et Pamela Ajuyah sont pris en charge par le Postgraduate Award australien. Nous tenons également à remercier le Réseau de recherche translationnelle sur le cancer, Centre de recherche sur le cancer Lowy, l'Université de Nouvelle-Galles du Sud et l'Unité de recherche translationnelle du cancer du Nord pour leur soutien supplémentaire de Samantha Khoury.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Centre, USA | TR 118 | – |
| RNase free H20 | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | – |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | – |
| Heavy Phaselock Tube | 5PRIME | 2302830 | 2ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5mg/ml |
| RNA grade Isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated Centrifuge | John Morris | – | – |
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | – | – |
| RNA grade Ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyser | Agilent, USA | – | – |
References
- Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
- Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
- Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
- Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
- Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
- Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
- Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
- Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
- Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
- McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).
